Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.
This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both “corpse assays” and “bite assays” on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.
उनके छोटे लेकिन जटिल नर्वस सिस्टम के साथ नेमाटोड व्यवहार सहित तंत्रिका जीव विज्ञान के कई पहलुओं को समझने के लिए शक्तिशाली उपकरण साबित कर दिया है। इस शोध के ज्यादातर मॉडल जीव Caenorhabditis एलिगेंस जिसमें अलग व्यवहार का खजाना सफलतापूर्वक विच्छेदित कर दिया गया है और विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित किया है। ये mechanosensory 3, 4 कीमोटैक्टिक, thermotactic 5,6 और 7 magnetotactic प्रभावित संभोग 8,9, 10 सीखने और खिला व्यवहार 11 में शामिल हैं। हालांकि, अन्य अधिक दूर से संबंधित निमेटोड प्रजातियों व्यवहार जो rhabditid सी में नहीं मनाया जाता प्रदर्शित एलिगेंस या वैकल्पिक रूप से जटिलता है, जो उनके विकास और विनियमन के संबंध में उचित सवाल उठता है की अतिरिक्त स्तर दिखा। इस का एक उदाहरण इस तरह दूर से संबंधित diplogastrid निमेटोड Pristionchus pacificus है, जो बहुत अधिक जटिल हो खिला प्रदर्शित करता है में मनाया जा सकता हैhaviors और से सी में मनाया जाता लय एलिगेंस 1। इस के बावजूद दो प्रजातियों के मुताबिक़ ग्रसनी न्यूरॉन्स 12 बांटने है। इन अतिरिक्त खिला व्यवहार, पी के साथ coinciding pacificus भी, एक विस्तारित आहार रेंज को प्रदर्शित करता है के रूप में वे शौकीन चावला शिकारियों भी अन्य नेमाटोड के लार्वा पर खिलाने से उनकी बैक्टीरियल आहार का सप्लीमेंट में सक्षम हैं। सौभाग्य से, पी pacificus तुलनात्मक और एकीकृत विकासवादी जीव विज्ञान के लिए एक मॉडल के रूप में विकसित किया गया है और इसलिए कई आणविक और आनुवंशिक उपकरण अब उपलब्ध हैं। ये एक पूरी तरह से अनुक्रम और एनोटेट जीनोम 13, 14 और ट्रांसजीन CRISPR / Cas9 15,16 के रूप में अच्छी तरह के रूप में अपनी नई खोज की बहन प्रजातियों सहित 25 से अधिक बारीकी से संबंधित प्रजातियों के साथ एक विस्तृत और अच्छी तरह से एनोटेट फिलोजेनी 17 सहित आणविक और आनुवंशिक उपकरण शामिल हैं। इसके अलावा, पी सहित कई Pristionchus प्रजातियों की पारिस्थितिकी pacificus हम हैडालूँगा कई प्रजातियों के साथ परिभाषित अब scarab बीटल के साथ एक necromenic एसोसिएशन, वे अक्सर अन्य निमेटोड प्रजातियों 18 के साथ साझा एक मेजबान बांटने का वर्णन किया गया है। पी pacificus इसलिए साथ जो व्यवहार उपन्यास के विकास और उनके पारिस्थितिक महत्व टुकड़े करना एक शानदार मॉडल प्रणाली प्रदान करता है।
आदेश में इस तरह के रूप में पी निमेटोड प्रजातियों में हिंसक खिला व्यवहार का विश्लेषण करने में pacificus हम आसान अवलोकन और हिंसक कार्रवाई की मात्रा का ठहराव के लिए कई उपन्यास व्यवहार assays विकसित की है। पी के रूप में pacificus एक द्विरूपी मुंह संरचना है, जो दृढ़ता से हिंसक व्यवहार को प्रभावित करती है, सही मोर्फोटाइप पहचान आवश्यक 1,2 है दिखाता है। संकीर्ण मुँह stenostomatous रूप एक भी कुंद पृष्ठीय दांत होते हैं और किसी भी हिंसक खिलाने में संलग्न नहीं है। वैकल्पिक रूप से, विस्तृत मुँह eurystomatous रूप में एक बहुत बड़ा पंजा आकार का पृष्ठीय दांत और एक अतिरिक्त का विरोध शामिलउप-उदर दांत, जो एक साथ कुशलता से अपने शिकार की छल्ली को खोलने के लिए कार्य करते हैं। गैर-हिंसक stenostomatous प्रपत्र को हिंसक eurystomatous के अनुपात पी भीतर Pristionchus प्रजातियों के बीच बदलता है और भी pacificus, तथापि, eurystomatous मुंह का प्रतिशत पी में morph 90% 2 – pacificus जंगली प्रकार तनाव (PS312) आम तौर पर 70 है। इसके अतिरिक्त, मुंह प्रपत्र अनुपात के पर्यावरणीय प्रभावों भिन्न (दोनों में जाना जाता है, भुखमरी और कुछ छोटे अणु के रूप में अच्छी तरह से अज्ञात कारकों के रूप में संकेत भी शामिल है), इस प्रकार सही पहचान और अलगाव हिंसक eurystomatous मुंह फार्म के आधार पर उतार चढ़ाव हो सकते सफल हिंसक assays के लिए आवश्यक है।
हिंसक मुंह प्रपत्र के विवरण के साथ-साथ हम प्रत्यक्ष अवलोकन और काटने की मौत हो गई और घटनाओं खिला सहित हिंसक व्यवहार की मात्रा का ठहराव के लिए एक "काटने परख" विकसित किया है। यहाँ शिकार नेमाटोड फिल्टर के माध्यम से अलग कर रहे हैंनव भूखे संस्कृतियों का हैैं और हिंसक वयस्क पी से अवगत कराया pacificus, जो थोड़े समय के अंतराल पर एक साथ मनाया जाता है। इसके अलावा, हम भी एक उच्च throughput "लाश परख" हिंसक घटनाओं के अप्रत्यक्ष अवलोकन के माध्यम से हिंसक व्यवहार की तेजी से जांच की सुविधा के लिए विकसित किया है। यह शिकार के लिए स्क्रीन के लिए एक उपकरण के रूप में लार्वा लाशों की मौजूदगी का फायदा उठाते हैं। दोनों assays देख और ऐसे पी के रूप में निमेटोड प्रजातियों में हिंसक व्यवहार को मापने के लिए आसान है और अत्यधिक repeatable तरीके प्रदान pacificus।
नेमाटोड सी के साथ तंत्रिका जीव विज्ञान और व्यवहार को समझने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान एलिगेंस इस प्रकार अब तक प्राथमिक उपकरण किया जा रहा है। पी सहित हालांकि, कई प्रजातियों निमेटोड pacificus प्रदर्शन व्यवहार है, जो अनुपस्थित रहे हैं या मॉडल जीव सी से जटिलताओं में भिन्नता एलिगेंस और इसलिए विकास और इन कार्यों के नियमन के बारे में आकर्षक सवाल उठा। ऐसा ही एक अतिरिक्त व्यवहार पी सहित कई अन्य निमेटोड प्रजातियों में पाया pacificus क्षमता हिंसक खिला 1, 20 में उलझाने के द्वारा अपने बैक्टीरियल आहार पूरक है। इसलिए हम विकसित किया है और नेमाटोड में ये पहले से unanalyzed हिंसक व्यवहार के लिए आसान और तेजी से लक्षण वर्णन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन किया है।
सबसे पहले, हम निमेटोड मुंह के भीतर तंत्र खिलाने में बदलाव के लिए स्क्रीन करने के तरीकों प्रदान की है। सही मुंह प्रकार की पहचान के लिए एक आवश्यक पहला s हैसफल शिकार assays के लिए TEP, के रूप में कम से कम Pristionchus जीनस के भीतर ही eurystomatous जानवरों हिंसक खिलाने में सक्षम हैं। यह सबसे अच्छा मुँह इस पद्धति के रूप में प्रोटोकॉल 1.2 में वर्णित "तेजी से मुंह phenotyping" प्रोटोकॉल के साथ morphs की पहचान है बहुत कम आक्रामक है और इसलिए यह कम संभावना है कि हिंसक व्यवहार परेशान किया जा सकता है। हालांकि, यह पहली अगर पैड पर anesthetized जानवरों (प्रोटोकॉल 1.1) के साथ पहचान से अलग मुंह संरचनाओं के साथ परिचित बनने के लिए सिफारिश की है।
वांछित मुंह रूप की पहचान के बाद, हम हिंसक खिला बढ़ाता के लिए दो assays का वर्णन किया है। ये एक तेजी से, उच्च throughput "लाश परख" (प्रोटोकॉल 3) और एक अधिक समय लगता है लेकिन अधिक गहराई "काटने परख" के माध्यम से व्यवहार विश्लेषण (प्रोटोकॉल 2) कर रहे हैं। इन प्रोटोकॉल के दोनों आदेश experimen के आधार पर assays अनुकूलन करने में कई संशोधनों के लिए अनुमति अत्यधिक लचीला कर रहे हैंताल आवश्यकताओं। पी का उपयोग कर काटने assays के लिए सी पर pacificus शिकारियों एलिगेंस शिकार, 10 मिनट की एक समय खिड़की के लिए हिंसक व्यवहार बातचीत की टिप्पणियों अन्य खिला घटनाओं के साथ-साथ काटने का एक महत्वपूर्ण राशि यों के लिए पर्याप्त था। "लाश assays" फिर पी के उपयोग के लिए सी पर pacificus शिकारियों एलिगेंस शिकार, 2 घंटे के लिए 5 शिकारियों आसानी से मात्रात्मक और लगातार लाश तेजी से व्यवहार विश्लेषण के लिए अनुमति संख्या का उत्पादन किया। हालांकि, यह अलग गति में हिंसक निमेटोड चाल की विभिन्न प्रजातियों ध्यान दिया जाना चाहिए, अलग दरों पर खाने के लिए और आम तौर पर अन्य व्यवहार 1 में एक बड़ी विविधता प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, विभिन्न शिकार प्रजातियों को भी इसी तरह के कारणों के लिए अलग-अलग दरों पर खाया जा सकता है। इसलिए यह पर्यावरण की स्थिति में कोई मतभेद के लिए दोनों का परीक्षण किया शिकारियों और शिकार के रूप में निमेटोड प्रजातियों पर आधारित assays के अनुकूलन करने के लिए सिफारिश की है, और भी है। दोनों "काटने" और "कोर के दौरानई "assays यह महत्वपूर्ण है कि दोनों शिकार और शिकारियों स्वस्थ रूप में जोर दिया या घायल शिकारियों कुशलता से मार नहीं होगा रहे हैं। इसके अलावा, नए सिरे से परख प्लेटें पुराने प्लेटों बाहर सूख जो प्रतिकूल गलत करने के लिए अग्रणी नेमाटोड के स्वास्थ्य को प्रभावित कर सकते हो के रूप में आवश्यक हैं assays। यह भी आशा व्यक्त की है कि इन हिंसक assays के भविष्य पुनरावृत्तियों क्रम में प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में हाल के अग्रिमों का लाभ लेने के विश्लेषण के ज्यादा स्वचालित करने में सक्षम के रूप में कई व्यवहार सी में मनाया एलिगेंस 21, 22 की जांच के लिए पूरा किया गया है हो सकता है। वर्तमान में समस्याओं ऐसे पी pacificus के रूप में नेमाटोड में पैदा होने की संभावना हैं, क्योंकि वे बहुत अधिक संवेदनशील संपर्क करने के लिए दिखाई देते हैं, हिंसक खिला रद्द करने की संभावना microfluidic कक्षों में अलगाव और स्थिरीकरण कर रही है। इस चुनौतीपूर्ण साबित हो सकता है, लेकिन अलग-अलग नेमाटोड सुविधा होगी पर काबू पाने सूक्ष्म हिंसक लिए जांच की जा करने के लिए व्यवहार।
अंत में, हम भी तरीके के लिए प्रदान की हैआर निमेटोड खिला तंत्र अपने आप में एक उच्च गति कैमरा (प्रोटोकॉल 4) का उपयोग दांत और ग्रसनी पंप कैनेटीक्स बढ़ाता द्वारा हिंसक और बैक्टीरियल खिला मोड के बीच तुलना की सुविधा की जांच। सी में ग्रसनी पंप दरों की मात्रा का ठहराव एलिगेंस सी कई वर्षों के लिए 23 खिला की निगरानी के लिए उपयोग किया गया है, हालांकि, एलिगेंस मुंह दंतिका के किसी भी रूप का अभाव है और भी हिंसक व्यवहार का अभाव है। ग्रसनी दांत गतिविधि के उस के साथ पम्पिंग की मात्रा का ठहराव के संयोजन के माध्यम से, दांत शिकार करने के लिए विशेष के किसी भी तंत्रिका वितरण भी देखा जा सकता है। बढ़ाई दांत आंदोलन पशु अक्सर फोकल हवाई जहाज़ से बाहर ले जाने के लिए निरीक्षण करने की आवश्यकता के कारण, इस प्रकार यह आमतौर पर ही संभव कम समय खिड़कियों के लिए दांत का निरीक्षण करने के लिए है। इसके अतिरिक्त, सी के विपरीत एलिगेंस, पी के ग्रसनी pacificus लगातार पंप नहीं है, बल्कि यह पंप और खिलाने के मंत्र में संलग्न है। इसलिए, सटीक ग्रसनी पम के लिएपिंग दरों जबकि खिला निर्धारित किया जाना है, यह निरंतर खिलाने के 15 सेकंड के रिकॉर्ड करने के लिए महत्वपूर्ण है।
यहाँ प्रस्तुत इन विधियों इसलिए निमेटोड प्रणालियों में हिंसक व्यवहार की जांच के लिए पहले ढांचा प्रदान करते हैं। इसके अलावा, वे भी सूक्ष्मजीवों, कवक और कण सहित शिकार पर अतिरिक्त पारिस्थितिकी प्रासंगिक जीवों के प्रभाव सहित निमेटोड पारिस्थितिकी तंत्र के भीतर अन्य बातचीत की जांच में उपयोग के लिए अनुकूल हो सकता है । इस प्रकार वे टुकड़े करना है कि कैसे इन हिंसक व्यवहार नियंत्रित कर रहे हैं, वे कैसे विकसित हो सकता है और यह भी उनके पारिस्थितिक महत्व एक साधन प्रदान करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Daniel Bumbarger for the predation behavior picture. This work was funded by the Max-Planck Society.
Nylon net filters (20 um) | Merck Millipore Ltd | NY2004700 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
PP Funnel for filter (54mm) | Duran | 292215003 | Used to filter worms just leaving larvae for use as prey. |
Small petri dish (35/10 mm) | Greiner Bio-One | 627102 | For imaging on High speed camera |
Zeiss SteREO Discovery V12 | For mouth form identificaton | ||
Axio-Imager A1 | For mouth form identificaton | ||
Glass Slides | Roth | H869 | |
Cover Slips | Roth | 657 | |
Motion Scope M3 Highspeed camera | IDT | High speed camera | |
Video zoom 44 ENG 1/2" 0.5x to 2.4x | Zeis | 452984-0000-000 | High speed camera zoom |
Nematode Growth Medium (NGM) ingredients: | |||
Agar | Roth | 5210.2 | CAS-Nr. 9002-18-0 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |
Bacto Tryptone | BD | 211699 | Lot 4316614 |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C3306 | CAS-Nr. 10035-04-8 |
Cholesterol from lanolin | Sigma-Aldrich | F 26732 00050 | CAS-Nr. 57-88-5 |
Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4) | Merck | 1,058,861,000 | CAS-Nr. 10034-99-8 |
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
6 cm petri dish | Greiner Bio-One | 628102 | |
3.5 cm petri dish | Greiner Bio-One | 627102 | |
M9 ingredients: | |||
Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | ACROS organics | 271080025 | CAS-Nr. 7778-77-0 |
Sodium hydrogen phosphate heptahydrate (NaHPO4) | Sigma-Aldrich | S9390-500G-D | CAS-Nr. 7782-85-6 |
Sodium chloride (NaCl) | Roth | 3957 | CAS-Nr. 7647-14-5 |