A protocol for the production, purification, and use of enzyme packaged outer membrane vesicles (OMV) providing for enhanced enzyme stability for implementation across diverse applications is presented.
Un creciente interés en la aplicación de técnicas de biología sintética para programar vesículas de membrana externa (OMV) están dando lugar a algunas aplicaciones muy interesantes y únicos para los OMV en nanopartículas tradicionales están resultando demasiado difícil de sintetizar. Hasta la fecha, todas las bacterias Gram-negativas se han demostrado para producir envases que demuestra OMV de una variedad de carga que incluye moléculas pequeñas, péptidos, proteínas y material genético. Sobre la base de su diversa carga, OMV están implicados en muchos procesos biológicos que van desde la comunicación célula-célula para la transferencia de genes y la entrega de factores de virulencia, dependiendo de que las bacterias están produciendo la OMV. Sólo recientemente se han vuelto accesibles para su uso en una amplia gama de aplicaciones a través del desarrollo de técnicas para controlar y envasado directa de proteínas recombinantes en bacterias OMV OMV. Este protocolo describe un método para la producción, purificación, y el uso de la enzima de envasados OMV proporcionar para mejorar la overall producción de la enzima recombinante, el aumento de vesiculación, y la estabilidad de la enzima mejorada. la utilización con éxito de este protocolo dará lugar a la creación de una cepa bacteriana que a la vez produce una proteína recombinante y la dirige para OMV de encapsulación a través de la creación de una unión sintética entre la proteína recombinante y una proteína de anclaje a la membrana externa. Este protocolo también se detallan los métodos para el aislamiento de OMV a partir de cultivos bacterianos, así como las técnicas apropiadas de manipulación y cosas para considerar cuando la adaptación de este protocolo para su uso en otras aplicaciones únicas, tales como: entrega de medicamentos, el diagnóstico médico, y la remediación ambiental.
Se presenta aquí un método para el diseño, la producción y purificación de vesículas de enzimas cargadas bacterianas de membrana externa (OMV). OMV son pequeños, principalmente unilamelar, proteoliposomas que varían en tamaño desde 30 hasta 200 nm de 1,2. Todas las bacterias Gram-negativas y Gram-positivas que han sido estudiados hasta la fecha han demostrado la liberación de cualquiera de las OMV o vesículas extracelulares (EV) de su superficie de 3,4. El mecanismo exacto por el cual se producen OMV aún no se han aclarado por completo debido a las diversas poblaciones bacterianas que ellos, así como las diferentes funciones que sirven secretan. OMV se ha demostrado que el transporte de una amplia gama de carga a partir de moléculas pequeñas, péptidos y proteínas al material genético que sirve una variedad de complejo de señalización, la translocación de genes, y la virulencia funciones 5,6.
Los mecanismos exactos de la biogénesis OMV no están bien caracterizadas, y parecen diferir entre especies bacterianas. A pesar de this hecho, hemos desarrollado un método para mejorar la eficacia de empaquetamiento de una proteína recombinante en OMV mediante la creación de una unión sintética entre una proteína de interés y una proteína muy abundante endógena a la membrana externa bacteriana y la posterior OMV. En ausencia de un enlace sintético, o afinidad constituida artificialmente, entre la proteína expresada de forma recombinante y la OMV la eficacia de empaquetamiento observada es muy bajo 7. Este resultado es de esperar que la incorporación de las proteínas dentro de la OMV se produce ya sea a través de la encapsulación azar en el preciso momento de la formación de OMV en la superficie bacteriana o por medio de envasado dirigido por mecanismos que no se comprenden bien. Algunos éxito se ha observado en el envasado de proteínas simplemente a través de más de expresión dentro del espacio periplásmico que se basa en la encapsulación azar pero el envase eficaz es altamente dependiente de la proteína con algunas proteínas de envasado a alta eficiencia en comparación con otros tha no empaquetar en absoluto 8-10. Mediante la utilización de técnicas de biología sintética comunes hemos tratado de diseñar Escherichia coli (E. coli) para producir al mismo tiempo, el paquete y segregan una enzima activa de interés en OMV que elude las limitaciones del conocimiento actual acerca de cómo se forman y cómo OMV de carga es seleccionada por las bacterias para embalaje.
Para los fines de esta solicitud se seleccionó un sistema de bioconjugación proteína de división como la unión sintética de elección para facilitar el embalaje direccional en la OMV. Como el nombre sugiere un sistema bioconjugation proteína de división se compone de dos dominios de subunidades complementarios que interactúan entre sí. Los dominios de la proteína de división seleccionados para los fines de este protocolo se conocen como la SpyCatcher (SC) y SpyTag dominio (ST) y se derivan de la proteína de unión a fibronectina pyogenes Streptococcus-(FbaB) 11. Este sistema de la proteína de división es inusual en que wuando las dos subunidades están dentro de la proximidad de un enlace isopeptide forma espontáneamente entre los extremos proximal aspártico residuos de ácido de ácidos y aminoácidos lisina que crean una unión covalente. Formación de enlaces isopeptídicos no requiere la adición de proteínas chaperonas, enzimas catalíticas, o cofactores y puede ocurrir fácilmente a temperatura ambiente (RT) y en un amplio rango de condiciones fisiológicamente relevantes 12.
Como prueba de concepto, se seleccionó fosfotriesterasa (PTE) (EC 3.1.8.1) de Brevundimonas diminuta para ser envasados en E. coli derivado OMV 13. PTE contiene un sitio activo Zn / Zn binuclear y tiene la capacidad de descomponer los fosfatos orgánicos a través de una reacción de hidrólisis convertir aryldialkylphosphates en dialquilfosfatos y alcoholes de arilo 14. La exposición a los organofosfatos afecta la función del neurotransmisor adecuada a través de la inhibición de la hidrólisis de la acetilcolina por la acetilcolinesterasa en las uniones neuromusculares Makincompuestos derivados organofosforados g extremadamente peligrosas 15. La exposición prolongada o significativa a organofosforados habitualmente da lugar a convulsiones incontrolables y por lo general causa la muerte a través de la asfixia. Mientras PTE exhibe la actividad catalítica más alta hacia paraoxón, un muy potente insecticida, también es capaz de hidrolizar una amplia gama de otros pesticidas y agentes nerviosos química V / G de tipo 16. Para facilitar el empaquetamiento OMV, un plásmido bacteriano fue diseñado que codifica una construcción génica que contiene un promotor inducible, una secuencia de localización periplásmica, y un corto sitio de clonación múltiple aguas arriba de la secuencia del gen SC. La inserción del gen PTE entre el líder y la secuencia SC permitido para la creación de un interruptor genético que se dirige a la proteína de fusión PTE-SC al espacio periplásmico para el envasado de OMV. Si bien los esfuerzos descritos aquí se centran en PTE, el gen de la enzima es intercambiable y fácilmente podría ser reemplazada con otra secuencia de gen a FACilitate envasado de una enzima o proteína alternativa.
A medida que la segunda parte de la ligamiento sintético, se elige una proteína de membrana externa abundante (OmpA) para presentar la secuencia del péptido ST. Si bien la elección de la proteína de anclaje puede variar, es esencial que la proteína tiene un dominio permisivo que presenta dentro del espacio periplásmico, tolera la construcción de fusión sin inducir citotoxicidad, se sabe que está presente en OMV, y no agregar cuando es recombinante producida. OmpA es una proteína transmembrana kDa porin 37.2 que se sabe que está altamente expresado en la membrana externa bacteriana y la posterior OMV 17. Se está implicada en el transporte de moléculas pequeñas, <2 nm de tamaño, a través de la membrana bacteriana 18. Nativo OmpA tiene dos dominios estructuralmente únicos, un motivo de barril beta transmembrana y una porción C-terminal periplasmically soluble conocido para interactuar con el peptidoglicano 19. En el designe de fusión OmpA-ST mutanted aquí se ha eliminado la porción C-terminal de OmpA y el ST se fusionó a la N- frente periplasmically o C-terminales. La eliminación de la porción periplásmico de OmpA disminuye el número de interacciones entre la membrana exterior y el peptidoglicano que resulta en la desestabilización de la membrana que conduce a la hiper-7 vesiculación. Genomic OmpA se mantuvo además de la construcción de OmpA-ST expresado de forma recombinante para mitigar la desestabilización de membrana bruta.
Este funciones de protocolo para demostrar un representante dirigidas técnica de embalaje en el que se produce y se empaqueta en OMV por E. coli una enzima de interés. Al igual que con muchas técnicas complejas hay varias áreas en las que el protocolo puede ser modificado para adaptarse a su uso en diferentes aplicaciones únicas, algunas de las cuales se detallan a continuación. Si bien el mecanismo de envases OMV y la encapsulación de la enzima se puede adaptar a las necesidades específicas hay varios …
The authors have nothing to disclose.
This research was funded by the Office of Naval Research through Core funds provided to the Naval Research Laboratory.
IPTG | Any | Always prepare fresh or aliquot and freeze. | |
L-arabinose | Any | Can be prepared ahead of time and stored at 4C. | |
Ampicillin | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
Chloramphenicol | Any | Add immediately prior to use after media cools sufficiently from being autoclaved. | |
TB/LB Culture Media | Any | Other growth medias will likely work similarly. | |
Triton X-100 | Any | One of many potential suitable surfactants. | |
Baffled culture flasks | Any | The baffles promote higher levels of aeration. | |
CHES | Fisher Bioreagents | BP318-100 | Optimal buffer used for paraoxon degredation (pH > 8). |
Paraoxon | Chem Service | N-12816 | Very toxic substance to be handled carefully and disposed of properly. |
Syringe Filter 0.45 µm | Thermo Scientific | 60183-221 (30 mm) | Filter diameter will depend on volume of sample. Low protein binding membrane is critical. |
Shaker incubator | New Brunswick | Excella E24 | Precise temperature and mixing is essential for reproducable bacterial growth. |
Sorvall Culture Centrifuge | Thermo Scientific | RC 5B PLUS | Large volume (500 mL) culture centrifuge capable of 7,000 x g. |
Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | WX Ultra 90 | Capable of centrifugal forces ≥150,000 x g. |
Ultracentrifuge Rotor | Thermo Scientific | AH-629 | Ensure the proper rotor and tubes are used and that everything is properly balanced. |
Ultra-Clear Ultracentrifuge Tubes (25 x 89 mm) | Beckman Coulter | 344058 | Ensure no stress fractures are present prior to use and that tubes are presicely balanced. |
Spectrophotometer | Tecan | Infinite M1000 | Necessary for enzyme kinetic assays. |
DLS / particle tracking | NanoSight | LM10 | Necessary for OMV size distribution and concentration determination. |
BL21(DE3) | NEB | Suitable bacterial expression strain. | |
pET22 | EMD Millipore | 69744-3 | Other plasmids can be used in place of these. |
pACYC184 | NEB | Other plasmids can be used in place of these. | |
Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Example kit. |