We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.
Membranproteiner (parlamentsmedlemmer) er væsentlige elementer i cellemembraner og primære drug targets. Rationel drug design bygger på præcise strukturel information, typisk ved krystallografi; imidlertid MP'er er vanskelige at krystallisere. Nylige fremskridt i MP strukturel bestemmelse har nydt godt af udviklingen af lipide kubiske fase (LCP) krystallisering metoder, som typisk afkaster godt diffrakterende, men ofte små krystaller, der lider skade stråling under traditionel krystallografiske dataindsamling på synkrotron kilder. Udviklingen af nye generation af X-ray free-elektron laser (XFEL) kilder, der producerer meget lyse femtosekund pulser har aktiveret værelse indsamlingen temperaturdata fra mikrokrystaller med ingen eller ubetydelig stråleskader. Vores seneste bestræbelser på at kombinere LCP-teknologi med seriel femtosekund krystallografi (LCP-SFX) har resulteret i høj opløsning strukturer af adskillige humane G-protein-koblede receptorer, which repræsenterer en notorisk vanskeligt mål for strukturbestemmelse. I LCP-SFX teknik, er LCP ansat som matrix for både vækst og levering af MP mikrokrystaller til skæringspunktet injektoren strøm med en XFEL stråle for krystallografiske dataindsamling. Det er blevet påvist, at LCP-SFX væsentligt kan forbedre diffraktion opløsning, når der kun sub-10 um krystaller er til rådighed, eller når brugen af mindre krystaller ved stuetemperatur kan overvinde forskellige problemer, der er forbundet med større cryocooled krystaller, såsom ophobning af fejl, høj mosaicity og cryocooling artefakter. Fremtidige fremskridt i X-ray kilder og detektor teknologier bør gøre seriel krystallografi meget attraktivt og praktisk for gennemførelsen ikke kun på XFELs, men også på mere tilgængelige synkrotron beamlines. Her præsenterer vi detaljerede visuelle protokoller til forberedelse, karakterisering og levering af mikrokrystaller i LCP for serielle krystallografiundersøgelser eksperimenter.Disse protokoller omfatter metoder til udførelse krystallisationseksperimenter i sprøjter, opdage og karakterisere de krystal prøver, optimering krystal tæthed, lastning mikrokrystal lastet LCP i injektoren enhed og levere prøven til bjælken til dataindsamling.
Røntgenkrystallografi er den mest succesfulde teknik til dato til løsning atomar opløsning strukturer af membranproteiner (MP). Krystallisation fra lipid mesofaser, også kendt som lipid kubiske fase (LCP), eller i meso krystallisering, repræsenterer en af de vigtigste udviklinger i MP krystallografi, der har gjort det muligt for høj opløsning struktur bestemmelse af udfordrende mål, såsom G-protein-koblede receptorer (GPCR ) 1. Nylige fremskridt i LCP værktøjer og teknologier har gjort denne teknik til rådighed for et stort fællesskab af strukturelle biologer verden over to. Men i mange tilfælde MP krystaller, der danner i LCP er for små til at blive brugt, selv ved mest avancerede microfocus synkrotron beamlines, hvor prøverne lider af svær stråling skader og forringelse, før der kan opnås tilstrækkelig signal ved høj opløsning 3.
En ny tilgang til krystallografisk dataindsamlingblev aktiveret med idriftsættelse af første X-ray free-elektron laser (XFEL). Metoden er baseret på princippet om "diffraktion før ødelæggelse", først introduceret teoretisk 4 og derefter bekræftet eksperimentelt på biologiske prøver på Linac Coherent Light Source (LCLS) 3, verdens pioner i hårde XFELs. En XFEL genererer høj lysstyrke X-ray pulser inden par snese femtosekund varighed, diffrakterer fra en uberørt krystal før protein atomerne kan bevæge sig som reaktion på skader stråling. I de indledende eksperimenter blev mikrokrystaller kontinuerligt til skæringspunktet med XFEL stråle i en vandig strøm produceret af en flydende injektor 5. Denne forsøgsopstilling er kendt som seriel femtosekund krystallografi (SFX). Den største ulempe ved anvendelse af flydende injektorer for SFX er deres høje strømningshastighed, som derfor kræver ti til hundrede milligram oprenset protein til opsamling af et komplet datasæt. Ved employing en speciel injektor, der kan håndtere de gel-lignende LCP prøver (LCP microextrusion injektor) 6, vi med succes leveret mikrokrystaller af flere forskellige menneskelige GPCR dyrket i en LCP matrix og fået deres høj opløsning strukturer 6-9, med en betydeligt reduceret protein forbrug til under 0,3 mg pr datasæt. Injektoren består af et reservoir, der kan indeholde op til 20, 40 eller 100 pi krystal-laden LCP og en smal kapillær (10-50 um i diameter), hvorigennem prøven ekstruderes ved anvendelse af et højt tryk (op til 10.000 psi) fra en hydraulisk stempel med et tryk amplificeret stadium, drevet af en væske fra en HPLC (højtydende væskekromatografi) pumpe. Strømmen af LCP forlader kapillardyse stabiliseres af en parallel strømning af ikke-reaktive gas (typisk helium eller nitrogen).
Her giver vi visuelle demonstrationer af de nødvendige skridt til at forberede og karakterisere prøverfor en LCP-SFX eksperiment. Yderligere detaljer kan findes i de offentliggjorte protokoller 10. Som et eksempel vil vi bruge adenosin A2A-receptor 11 og forberede krystaller af dette protein i LCP for X-ray dataindsamling hjælp SFX tilgang. Mens vores protokoller er kompatible med alle injektor stand til streaming LCP til indsamling af data ved seriel krystallografi på XFEL og synkrotron kilder, til illustration, vil vi bruge LCP injektor beskrevet i ref. 6. Optimerede fældningsmiddel betingelser, der producerer high-density mikrokrystaller i LCP skal identificeres ved high-throughput krystallisering screening 12,13 før du fortsætter til denne protokol. En typisk rutediagram for denne protokol er vist i figur 1.
De her beskrevne protokoller giver en generel oversigt over proceduren prøveforberedelse for en standard LCP-SFX eksperiment med en LCP injektor. Baseret på vores erfaringer, det samlede beløb for den endelige mikrokrystal-laden LCP prøve kræves til opsamling af en fuld datasæt er typisk 50-100 pi (tabel 1; 25-50 pi af indledende protein-laden LCP prøve), afhængigt af mikrokrystallen størrelse , kvalitet og tæthed. Da hver 100 pi gastæt glassprøjte kan rumme ca. 7 pi LCP i form af en fuldt udstrakt streng for at sikre korrekt og jævn fordeling af fældningsmiddel opløsningen i LCP, bør mindst fire til syv prøver i sprøjter forberedes hver LCP-SFX eksperiment.
Da prøven ekstruderes gennem en smal 20-50 um i kapillær diameter, er det afgørende at undgå enhver fremmede partikler materiale i prøven. Støv og fibre, der kan lejlighedsvis indført i LCPprøve eller fældningsmiddel opløsninger kan tilstoppe injektoren kapillar og øge stilstandstid under eksperimentet. Derfor er det vigtigt at foretage lipid og alle opløsninger gennem et 5 um pore filter før forberedelse prøver. Eventuelt kan et rent rum eller en bærbar clean room hætte anvendes til prøvefremstilling.
Disse protokoller er baseret på brug 9,9 MAG (monoolein) som vært lipid for MP krystallisering. De er imidlertid ikke begrænset til 9,9 MAG og kan nemt tilpasses til andre LCP vært lipider eller lipid blandinger efter at have taget hensyn til forskellene i lipidfasen adfærd. De fleste af strukturerne af MP'er krystalliseret i LCP blev opnået under anvendelse af en af blade, med 9,9 MAG er den mest succesfulde repræsentant hidtil 15. Den største ulempe ved anvendelse af 9,9 MAG for SFX er dens overgang til lamellar krystal fase ved afkøling under 18 ° C, hvilket ofte sker, når erhvervelsen af data foretages i vakuum. Den titratipå med 7,9 MAG beskrevet i afsnit 5 i denne protokol giver en god løsning på dette problem. Det er vores erfaring, krystaller modstå sådan titrering uden nogen bivirkninger. Men hvis tilsætningen af 7,9 MAG eller anden kort-kædet MAG er ikke ønskeligt, kan titreringen udføres med 9,9 MAG. I dette tilfælde bør den gas, der stabiliserer strømningen af LCP under injektion i vakuum ændres fra helium til nitrogen, som kan forhindre dannelsen af en krystallinsk lipidfase i de fleste prøver, på bekostning af at have en mindre stabil prøvestrømmen.
Den gelagtige konsistens af LCP har en stor fordel til anvendelse som en krystal bæremedium, da det giver mulighed for justering af krystal strømningshastighed over et bredt område, der er egnet til seriel krystallografi dataindsamling på moderne XFEL og synkrotron kilder. Matchende krystal strømningshastigheden med XFEL puls gentagelse sats resulterer i dramatisk reduktion i krystal forbrug størrelsesordener compared til flydende injektion. LCP er en egnet bæremedium til afgivelse af ikke blot MP krystaller dyrkes i det, men også for krystaller af opløselige proteiner 21. Flere alternative tyktflydende krystal databærere er for nylig blevet indført 22-24, udvide arsenal af værktøjer og reagenser til udførelse af serielle krystallografiundersøgelser eksperimenter. Desuden har seriel krystallografi med LCP som en krystal leveringsmedium blevet demonstreret ved konventionelle synkrotron kilder, i det mindste for well-afbøjende krystaller 24,25. Fremtidige opgraderinger af synkrotron kilder, øge røntgen intensitet af størrelsesordener, samt forbedringer i detektor teknologi, vil gøre seriel krystallografi en endnu mere tilgængelig og attraktiv metode til struktur bestemmelse.
LCP-SFX har vist sin styrke til MP strukturel bestemmelse. For udfordrende biologiske systemer (såsom GPCR eller makromolekylære komplekser) hvor Large, diffraktion kvalitet krystaller er vanskelige at dyrke, kan LCP-SFX tilvejebringe et attraktivt, hvis ikke den eneste, realistisk mulighed for at løse en atomar opløsning struktur. Med alle sine fordele, dvs. ved brug LCP som matrix for MP krystallisering og krystal levering, lavt forbrug protein, fravær af skader stråling, temperatur dataindsamling værelse, mulighederne for tid-løst undersøgelser 26,27 og ingen krav krystal høst, LCP SFX bør spille en vigtig rolle i den fremtidige strukturelle biologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health giver R01 GM108635 og U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU Collaborative Seed Grant Award og NSF STC award 1231306. Vi takker A. Walker for hjælp med manuskriptet forberedelse.
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Nu Chek Prep | M239 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) | Sigma | M7765 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) | Nu Chek Prep | M219 | Hosting lipid for the protein to be crystallized |
LCP host lipid 7.9 MAG | Avanti Polar Lipids | 850534 | Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection |
Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/mL | Target protein | ||
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | Used to dissolve lipids |
Methanol | Sigma-Aldrich | 179337-500ML | Used to wash syringes |
Eleven 100 mL Hamilton gas-tight syringes without needles | Hamilton | 7656-01 | For LCP preparation |
Eight syringe couplers | Hamilton | SKU 209526 | For LCP preparation |
Removable flat-tipped needle | Hamilton | 7804-01 | For LCP dispensing |
Parafilm | Parafilm | M', 250' x 2" | Used for syringe sealing |
Lint free lens cleaning tissues | Fisher | NC9592151 | |
Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 mL, Durapore 5 µm | Millipore | UFC3 0SV 00 | Used for filtering of precipitant solutions and lipids |
Microscope slides, 1 inch x 3 inch | GoldSeal | 3010 | |
Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol | VWR | 89094-640 | These are used to clean the syringes, needles and coupler. Methanol is used first, then water. |
Gloves | Microflex | XC-310-L | For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers |
Safety glasses | |||
Pressurized air cans | Office Depot (Dust-Off) | 527494 | For syringe cleaning |
Dry block heater with a digital temperature controller | Fisher | 11-720-10BQ | Used for thawing lipids |
Benchtop Centrifuge | Fisher | 05-413-340 | Spinning down solutions |
Clean Room Mini – 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter | Sentry Air Systems, Inc. | SS-112-PCR | Cleaning sample preparation |
Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer | Nikon | SMZ1500 | Crystal density check |
UV microscope | JAN Scientific | UVEX-P | Optional, for crystal imaging purposes |
SHG imager | Formulatrix | SONICC | Optional, for crystal imaging purposes |