Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54463
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3
1The Bridge Institute, University of Southern California, 2Department of Chemistry, University of Southern California, 3School of Molecular Sciences, Center for Applied Structural Discovery at the Biodesign Institute, Arizona State University

Abstract

חלבוני ממברנה (MPS) הם מרכיבים חיוניים של קרום תא ויעדי תרופה עיקריים. תכנון תרופות Rational מסתמך על מידע מבני מדויק, בדרך כלל מתקבל על ידי קריסטלוגרפיה; אולם חברי פרלמנט קשים להתגבש. התקדמות אחרונות נחישות מבניים MP הרוויחה מאוד מפיתוח השלב מעוקב lipidic (LCP) שיטות התגבשות, אשר בדרך כלל תשואה היטב diffracting, אבל לעתים קרובות גבישים קטנים אשר סובלים מנזקי הקרינה במהלך איסוף הנתונים crystallographic מסורתי מקורות synchrotron. פיתוח לייזר אלקטרונים חופשיים מהדור החדש רנטגן (XFEL) מקורות המייצרים פולסים femtosecond בהיר מאוד איפשר איסוף נתונים בטמפרטורת החדר מן microcrystals עם שום או נזקי קרינה זניחה. המאמצים האחרונים שלנו בשילוב הטכנולוגיה LCP עם קריסטלוגרפיה femtosecond סדרתי (LCP-SFX) גרמו מבנים ברזולוציה גבוהה של כמה קולטנים האדם G מצמידים חלבון, which מהווה יעד קשה לשמצה קביעת מבנה. בטכניקה LCP-SFX, LCP מגויסת כמטריצה ​​הן צמיחה ואספקה ​​של microcrystals MP לצומת של הנחל מזרק עם קרן XFEL לאספת נתונים crystallographic. הוכח כי LCP-אפקטים מיוחדים יכולים לשפר את הרזולוציה העקיפה מהותי כאשר רק גבישים תת-10 מיקרומטר זמינים, או כאשר השימוש של גבישים קטנים יותר בטמפרטורת חדר יכול להתגבר על בעיות שונות הקשורות גבישי cryocooled גדולים יותר, כמו הצטברות של פגמים, mosaicity גבוהה וחפצי cryocooling. התקדמות בעתיד במקורות רנטגן וטכנולוגיות גלאי צריכה לעשות קריסטלוגרפיה סדרה אטרקטיבית מאוד מבחינה מעשית ליישום לא רק XFELs, אלא גם beamlines סינכרוטרון הנגיש יותר. כאן אנו מציגים פרוטוקולים חזותיים מפורטים להכנה, אפיון מסירת microcrystals ב LCP לניסויים קריסטלוגרפיה סדר.פרוטוקולים אלה כוללים שיטות לביצוע ניסויי התגבשות מזרקים, גילוי ואפיון דגימות הקריסטל, אופטימיזציה צפיפות קריסטל, טעינת LCP העמוס microcrystal לתוך מכשיר המזרק ושולחי המדגם אל הקורה לאספת נתונים.

Introduction

רנטגן קריסטלוגרפיה היא הטכניקה המוצלחת ביותר עד כה לפתרון מבנים אטומי ברזולוציה של חלבונים בממברנה (חברי פרלמנט). התגבשות מ mesophases lipidic, הידוע גם בשם השלב מעוקב lipidic (LCP), או התגבשות טווינה, מייצג את אחד מההתפתחויות העיקריות קריסטלוגרפיה MP כי אפשרה קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של מטרות מאתגרות כגון חלבון בשילוב קולטנים G (GPCRs 1). הפיתוחים האחרונים בכלים וטכנולוגיות LCP הפכו טכניקה זו לרשות קהילה גדולה של ביולוגים מבניים ברחבי העולם 2. עם זאת, במקרים רבים הגבישים MP כי הטופס LCP הם קטנים מדי כדי לשמש אפילו המתקדמת ביותר beamlines סינכרוטרון microfocus, שבו דגימות סובלים מנזקי הקרינה חמורה והידרדרות לפני האות חזקה מספיק ברזולוציה גבוהה ניתן להשיג 3.

גישה חדשה לאיסוף נתונים crystallographicהתאפשרה עם המזמין של רנטגן אלקטרונים חופשיים לייזר (XFEL) הראשון. השיטה מבוססת על העיקרון של "עקיף לפני החורבן", הוצג לראשונה באופן תיאורטי 4 ולאחר מכן ניסוי אשר על דגימות ביולוגיות על מקור אור Linac קוהרנטית (LCLS) 3, החלוץ בעולם XFELs הקשה. XFEL מייצר פולסים רנטגן בהירות גבוהה בתוך כמה עשרות משך femtosecond כי diffract מגביש וטהור לפני אטומים חלבון יכול לנוע בתגובה לנזקי קרינה. בניסויים הראשוניים, microcrystals סופקו באופן רציף עד לצומת עם קורה XFEL בזרם מימי המיוצר על ידי מזרק נוזל 5. התקנה ניסיונית תופעה זו ידועה בשם קריסטלוגרפיה femtosecond סדרתי (SFX). החסרון העיקרי באמצעות מרססים נוזלים SFX הוא קצב הזרימה הגבוה שלהם, אשר כתוצאה מכך דורש עשרות עד מאה מיליגרם של חלבון מטוהר לאיסוף במערך שלם. על ידי EMPloying מזרק מיוחד שיכול לטפל דגימות LCP דמוי ג'ל (מזרק microextrusion LCP) 6, העברנו microcrystals בהצלחה של GPCRs אדם שונים הגדלים מטריצה ​​LCP וקיבלנו מבנים ברזולוציה גבוהה שלהם 6 - 9, עם חלבון מופחת משמעותית צריכה תחת 0.3 מ"ג בכל מערך נתונים. ההזרקה מורכבת ממאגר שיכול להכיל עד 20, 40 או 100 μl של LCP קריסטל-לאדן נימי צר (10-50 מיקרומטר קוטר) שדרכו המדגם הנמתח על ידי יישום של לחץ גבוה (עד 10,000 psi) מתוך בוכנה הידראולית עם במה מוגברת לחץ, מונעת על ידי נוזל משאבת HPLC (בעל ביצועים גבוהים נוזלת כרומטוגרפיה). זרם LCP יציאת זרבובית הנימים הוא התייצב על ידי זרימה מקבילה של גז nonreactive (בדרך כלל הליום או חנקן).

כאן אנו מספקים הפגנות חזותיות של הצעדים הנדרשים כדי להכין ולאפיין דגימותעבור ניסוי LCP-SFX. ניתן למצוא פרטים נוספים בפרוטוקולים שפורסמו 10. כדוגמה, נשתמש אדנוזין קולט 2A 11 ולהכין גבישים של החלבון הזה ב LCP לאיסוף נתונים רנטגן שימוש בגישה SFX. בעוד הפרוטוקולים שלנו עולים בקנה אחד עם כל מזרק מסוגל הזרמת LCP עבור איסוף נתונים על ידי קריסטלוגרפיה סדר במקורות XFEL ו synchrotron, להמחשה, נשתמש מזרק LCP המתואר Ref. 6. תנאים נמהרים אופטימליים המייצרים microcrystals צפיפות גבוהה LCP צריכים להיות מזוהים על ידי התגבשות תפוקה גבוהה הקרנת 12,13 לפני שתמשיך בפרוטוקול זה. תרשים זרימה טיפוסי עבור פרוטוקול זה מוצג באיור 1.

Protocol

1. פתרונות סינון ליפידים

הערה: כל ריאגנטים והכלים המשמשים פרוטוקול זה צריכים להיות נקיים ככל האפשר, כדי למנוע את כניסתה של מזהמי חלקיקים בדגימות, אשר עלול להדביק את מזרק LCP.

  1. לסנן את כל הפתרונים נמהרים והשומנים מותכים דרך מסנני 5 מיקרומטר ספין למטה. מזרקים לנקות ביסודיות ולהחיל אוויר דחוס לייבוש. לחלופין, להשתמש במנדף נייד נקי-מקום למנוע השמנת חלקיקי אבק או סיבים במהלך הליכי הכנת מדגם.

כינון 2. MP ב LCP

הערה: הבחירה של השומנים המארחים LCP הטובים ביותר עבור התגבשות תלויה היעד MP, ומזוהית בדרך כלל במהלך ניסויי התגבשות הקרנת שומנים מארחים 14. Monoacylglycerols (מגז) מייצג את המעמד הנפוץ ביותר של שומנים המשמשים התגבשות LCP 15. הפרוטוקולים מבוססים על שימוש 9.9 MAG (monoolein) כמולארח שומנים, שכן זהו השומנים המצליחים ביותר עבור התגבשות טווה עד כה 16. 9.9 MAG ניתן להחליף על ידי שומנים מארחים LCP אחרים או תערובות שומנים לאחר שלקח בחשבון את הבדלים בהתנהגות השלב שלהם. למשל, במקרה של GPCRs, monoolein היא מסוממת בדרך כלל עם כולסטרול לייצוב הקולטן. הנה, השתמש 9: 1 (w / w) 9.9 MAG: תערובת כולסטרול כמו השומנים המארחים.

  1. מערבב למקד MP, אשר מטוהר בתמיסת micelle חומרי הניקוי, עם השומנים המארחים LCP המתאימים באמצעות שני מזרקים (# 1 ו # 2) ו מצמד, כפי שתואר לעיל 13.
  2. בקצרה, מזרק עומס # 1 עם השומנים המותכים מזרק # 2 עם פתרון MP. השתמש יחס בין שומני פתרון MP מימייה המקביל לרמה כי הוא ממש מתחת קיבולת הידרציה המקסימלי של השומנים המארחים LCP המתאים, למשל, 3: 2 V / V שומנים / פתרון MP עבור 9.9 MAG, 1: 1 v / v פתרון שומנים / MP עבור רוב עיתוני שרשרת קצרים אחרים (7.9 MAG, 9.7 MAG, וכו ').
  3. חבר את המזרקים באמצעות מצמד מזרק ולהתחיל ערבוב החומרים מדכאים את הבוכנות להעביר את התערובת הלוך ושוב בין המזרקים, עד המדגם הופך הומוגנית ושקוף. הכן כ 50 μl של מדגם LCP לאיסוף בסיס נתונים מלאים על ידי LCP-SFX. היקף המדגם הסופי כלל יגדל בכ פי שניים (כדי ~ 100 μl) לאחר איחוד מדגם טיטרציה שומנים (סעיף 5).

3. הגדרת התגבשות ב מזרקים

  1. לאחר LCP שקוף הומוגני נוצר, להזיז את המדגם כולו לתוך מזרק # 2. ניתוק מזרק # 1, תוך שמירה על המצמד מחובר מזרק # 2.
  2. חבר מחט נשלף (26s מד) עד 100 μl אחר מזרק נקי (מזרק # 3) ואת לשאוב כ 70 μl של פתרון נמהר לתוכו. רכב הפתרון הנמהר שמפעיל formation של microcrystals בצפיפות גבוהה הוא ייחודי לכל יעד MP ו צריך להיקבע לפני שתמשיך הפרוטוקולים הללו. הנה, להשתמש הרכב פתרון נמהר אופטימיזציה המניב מקלחות של microcrystals של הקולטן 2A (40 מ"מ thiocyanate נתרן, 100 מ"מ נתרן ציטרט pH 5, 26-28% PEG400).
  3. ניתק את המחט במזרק # 3 תוך שמירה על טבעת חזוק הטפלון בתוך המזרק.
  4. חבר מזרקים # 2 ו # 3 דרך המצמד, ולוודא כי ferrules הטפלון נמצא במקום כראוי בשני המזרקים. בזהירות בורג מצמד בחוזקה למקומו.
  5. אוריינט המזרקים המצמידים אנכי עם מזרק # 2 על הקרקעית ולהזריק מדגם LCP עמוס חלבון מן המזרק # 2 לתוך מזרק # 3 לאט ובהתמדה עד שחוט LCP נוגע הבוכנה של מזרק # 3. היקף LCP המוזרק יסתכם בכ 1/10 המנפח הנמהר הראשוני מזרק # 3 (~ 7 μl). בדוק את עוצמת הקול על ידי קריאה בקנה מידה משני syringes (שני הבוכנות צריכות להזיז בכ -7 μl).
  6. # 2 מזרק נתק. המצמד עכשיו מחובר רק כדי מזרק # 3 המכיל את המדגם שקוע בפתרון הנמהר.
  7. השתמש Parafilm לאטום לחלוטין מזרק # 3, כולל ממשק מזרק הבוכנה, סוף הפתיחה של המצמד ואת אגוז מחט. איטום Incomplete במהלך שלב זה יכול לגרום תנאים הנמהרים לשנות את המדגם כדי לייבש.
  8. חזור על שלבים 3.3-3.7 להקים התגבשות 6 מזרקים נוספים (# 4 # 9) ניצול סך של ~ 50 μl של המדגם LCP (~ 7 μl של LCP לכל מזרק).
  9. חנות אטום מזרקים בשקית סגר פלסטיק עם אחד או שניים רקמות ניקוי ללא סיבים מראש ספוגה במים על מנת להגן מפני התייבשות המדגם. חותם את מזרקי שקית ולאחסן C חמם 20 ° במהלך צמיחת קריסטל.

4. איתור קריסטל

  1. הסר את המזרקים מן החממה לדמות את LCP דגימות ישירות בתוך המזרקים (# 3 # 9) כל 12-24 שעות תחת סטראו עם אור מקוטב צולב. לזהות גבישים כחלקיקים מבריקים צפופים או, במקרה של גודל גביש קטן כמו זוהר מדים מי נימת LCP.
  2. החזר את המזרקים החתומים על התיק, ולאחסן ב -20 ° C לשימוש עתידי.

5. איחוד לדוגמא טיטרציה עם 7.9 MAG

הערה: שלב טיטרציה שומנים המתוארים כאן משרת שתי מטרות: א) כדי לספוג את הפתרון הנמהר העודף ב) כדי למנוע שומנים הקפיאו על זריקה לתוך קורה XFEL. כאשר מדגם LCP מורכב 9.9 MAG מוזרק לתוך תא ואקום עבור איסוף נתונים, אידוי אינטנסיבי יכול לקרר את המדגם למטה לטמפרטורות מתחת לטמפרטורת המעבר לשלב שיווי המשקל (~ 18 ° C), המרת חלקים של המדגם לשלב גבישים שבשבת (LC). תיקונים אלה של שלב Lc, כאשר נפגעו על ידי הקרן, לייצר diffr אבקה האינטנסיביתטבעות פעולה שיכולה לגרום נזק גלאי רגיש 6, כגון גלאי מערך פיקסל קורנל-SLAC (CSPAD). טיטרציה של מדגם 9.9 MAG עם שומני שרשרת קצרים (9.7 MAG או 7.9 MAG) מקל בעיה זו, כמו שיש תערובות כגון טמפרטורות המעבר לשלב תחתונות. כאן אנו מתארים טיטרציה של LCP מורכב 9.9 MAG עם 7.9 MAG. כאשר מגס שרשרת קצר (9.7 MAG, 7.9 MAG, וכו ') משמש התגבשות או כאשר נתוני קריסטלוגרפיה סדרה נאספים בלחץ סביבת טיטרציה בשלב 5.11 עדיין נדרש, אבל זה יכול להתבצע באמצעות השומנים המארחים LCP המקוריים מועסקים הִתגַבְּשׁוּת.

  1. כ -1 שעה לפני תחילת איסוף הנתונים, הסר מזרקים עם דגימות מן החממה C 20 °.
  2. בחר 2-4 מזרקים עבור קונסולידציה מדגמת מבוסס על מראה קריסטל דומה דמיון של התגבשות תנאים.
  3. מוציאים בזהירות את Parafilm איטום מן מזרקים שנבחרו.
  4. לְהַסִירמצמד המזרק ולצרף מחט נשלפת נקיה (26s מד) על המזרק הראשון שנבחר. בעדינות ולאט לאט לדחוף את הבוכנה קדימה כדי לסחוט את נמהר דרך המחט לתוך צינור microcentrifuge. נהג במשנה זהירות בשלב זה כי החלת בלחץ גבוה על הבוכנה בשלב זה יכול להוציא חלק LCP קריסטל לאדן יחד עם פתרון נמהר, שמוביל לאובדן חלקי או מלא של המדגם.
  5. עצור את הבוכנה כשרוב הנמהר הוסרה ואת LCP צברה בכניסת המחט.
  6. חזור על שלב 5.4-5.5 עם מזרקים נבחרים אחרים.
  7. כדי לבסס את דגימות LCP כתוצאה, לחבר שני מזרקים יחד דרך מצמד נקי.
  8. לוחץ על המתג על המזרק אחד להעביר את המדגם מאחד המזרקים למשנהו.
  9. ניתק את המזרק הריק.
  10. חזור על שלבים 5.7-5.9 כדי לאחד את כל החומר LCP קריסטל עמוס מן מראש שני כדי ארבעהמזרקי -selected לתוך מזרק אחד. סר כמו נמהר ככל האפשר.
  11. הוסף את ~ 5 μl של 7.9 MAG או השומנים המארחים MAG קצר-שרשרת המקוריות במזרק ריק. חבר מזרק זה המזרק עם המדגם המאוחד באמצעות מצמד מזרק ומערבב לחלופין על ידי בוכנות מזרק מדכאים. חזור על הפעולה עד כל פתרון שיורית נספג וכן LCP הומוגנית ושקופה נוצר. הסכום הסופי של LCP לאחר טיטרציה יכול לנוע בין 20 כדי 35 μl בהתאם לכמות של נמהר העודף וההרכבה.
  12. הזז את מדגם LCP המעורב כולו לתוך מזרק אחד מהם, ניתק את המזרק הריק.

אפיון 6. microcrystals

  1. צרף מחט טעינת LCP-מזרק (נקודת סגנון 3, מד 22, שני סנטימטרים באורך) על המזרק עם מדגם מאוחד.
  2. בזהירות להוציא ~ 1 μl של המדגם LCP בשקופית זכוכית ולכסות אותו עם תלוש כיסוי זכוכית. לחץ בעדינות עללהחליק את המכסה כדי כריך המדגם.
  3. קח תמונות של המדגם LCP תחת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה הגבוהה ביותר האפשרית (בדרך כלל 100X) באמצעות תאורה בהירה שדה ו-מקטבים צלב. במידת האפשר, לקחת תמונות נוספות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי-UV ו SONICC (מסדר שני קוי הדמיה של קריסטלים כיראלי) 17 תרמי כדי לאשר את קיומו של microcrystals חלבון במדגם.
  4. הערכת גודל גביש וצפיפות 10. צפיפות הגביש האידיאלית עבור ניסוי איסוף נתונים תהיה תלוי בגודל קריסטל, הקוטר של קרן הרנטגן ואת הקוטר של נחל LCP, וצריכה להביא לשיעור להיט קריסטל של כ 10-40%.

התאמת 7. של צפיפות קריסטל

הערה: אם צפיפות הקריסטל נמצאה שלב 6.4 הוא גבוה מדי, וכתוצאה מכך אחוז גדול של להיטי קריסטל מרובים, הגבישים צריכים להיות מדוללים בעקבות הצעדים המפורטים להלן כדי לייעל אתדגימה עבור איסוף נתונים. אם צפיפות הקריסטל היא נמוכה מדי עבור איסוף נתונים ויעיל בכל הדגימות המוכנות, אז תנאי צמיחת קריסטל ראוי לעיין מחדש אופטימיזציה, שכן אין שיטה אמינה לריכוז גבישי MP ב LCP.

  1. הכן את הכמות הנדרשת של LCP מסודר לשמש דילול בכך שהם מחקים את הרכב LCP (באותו שומנים נמהרים) של המדגם המקורי עם גבישים שצריך להיות מדוללים.
  2. להעביר את כל LCP הטהור אל תוך מזרק אחד. ניתוק מזרק ריק אבל להשאיר את המצמד המחובר.
  3. הסר את המחט מן המזרק המכיל מדגם LCP עם microcrystals. חברו את המזרק מדגם מזרק המכיל LCP מסודר דרך מצמד.
  4. מערבבים את התוכן של מזרקים ידי דחיפתו קדימה ואחורה דרך מצמד עד הומוגניות מושגת.
  5. מקטע חוזר 6 להעריך מחדש את הצפיפות microcrystal במדגם המתואם.

8. LCP עם טעינת Injectornd LCP-SFX איסוף נתונים

  1. ניתק המצמד מן המזרק עם המדגם ולצרף מחט טעינת 1 "אל המזרק.
  2. העבר 20-40 μl של המדגם לתוך המאגר של מזרק LCP.
  3. הכנס את מזרק LCP לתוך תא המדגם 18, להתחיל את ההזרקה, להתאים את קצב הזרימה ולאסוף נתוני LCP-SFX.

9. גבישי חלבון התאגדות של מסיס LCP

הערה: שימוש בחומרים צמיגים מאוד, כגון LCP, למסירה של גבישים של חלבונים מסיסים מאפשר אחד כדי להקטין את צריכת חלבון דראמטי בניסוי קריסטלוגרפיה סדר. בצעדים אלה אנו מתארים כיצד לשלב גבישים של חלבונים מסיסים LCP. קריסטלים ניתן להשיג על ידי כל טכניקה, שאוחדו יחד בצורה של תליוני קריסטל ומסוננים במידת הצורך.

  1. התאם צפיפות קריסטל השעיה כדי להבטיח שיעורי להיט קריסטל של כ 10-40%.
  2. Test את התאימות של הפתרון הנמהר עם LCP באמצעות 7.9 MAG, 9.7 MAG או 1: תערובת 1 של 7.9 MAG ו -9.9 MAG כמו השומנים המארחים.
  3. מערבבים ~ 25 μl של תליוני קריסטל עם ~ 25 μl של השומנים המארחים בעזרת מערבל מזרק עד להיווצרות LCP הומוגנית.
  4. הערכת גודל וצפיפות קריסטל כמתואר טען סעיף 6. המדגם ההזרקה LCP ולאסוף נתונים כמפורט בסעיף 8.

Representative Results

להלן נתאר תוצאות נציג שהושגו עם דגימות שהכינו בעקבות הפרוטוקולים הנ"ל, אשר אפשרו לנו לאסוף נתוני SFX ולפתור מבנים ברזולוציה גבוהה של חמישה GPCRs אדם: קולטן הסרוטונין 5-HT 2B בקומפלקס עם אגוניסט ארגוטמין 8 (PDB מזהה 4NC3 קולטן, smoothened) (SMO) בקומפלקס עם אנטגוניסט cyclopamine 6 (PDB מזהה 4O9R), δ-אופיואידים קולטן בקומפלקס עם ליגנד פפטיד דו-תפקודית DIPP-NH 2 7 (4RWD מזהה PDB), הקולטן לאנגיוטנסין בקומפלקס עם חוסם ZD7155 9 (PDB מזהה 4YAY), וכן קומפלקס בין rhodopsin ו arrestin 19 (PDB מזהה 4ZWJ); ושני מבחן חלבונים מסיסים: ליזוזים (PDB מזהה 4ZIX) ו phycocyanin (PDB מזהה 4ZIZ).

5-HT 2B מתווך פונקציות פיסיולוגיות מרכזיות והיקפיות שונות של הנוירוטרנסמיטר סרוטונין. קולטן זהשמש להקים ולאמת את שיטת LCP-SFX, על ידי השוואת המבנה בטמפרטורת החדר המתקבל LCLS עם מבנה cryocooled לפתור על ידי microcrystallography המסורתי המתקדם פוטון המקור (APS). סך של מדגם LCP ~ 100 μl עם microcrystals חלבון (גודל ממוצע של כ -5 מיקרומטר) הוכן המשמש לאיסוף נתוני SFX, ומבנה LCP-SFX של 5HT 2B נפתר בהצלחה 2.8 A (איור 2) 8. פרטים שימושיים נוספים על הכנת המדגם ואיסוף נתונים ניתנים בטבלה 1.

קולטן smoothened (SMO) הוא חבר של מעמד גבוה full GPCRs ויעד המולקולרי של cyclopamine teratogen, עם פונקציות-הפגינו גם בשלבי ההתפתחות העוברית צמיחת הגידול. בתחילה, יחסית גבישים גדולים של SMO / cyclopamine בהיקף ממוצע של 120 × 10 × 5 מיקרומטר התקבלו ולאחר מכן השתמשו עבור collecti נתוניםעל ב מקור סינכרוטרון באמצעות קריסטלוגרפיה goniometer המבוסס קונבנציונלית. עם זאת, גבישים גדולים אלה מיוצר עקיפה ענייה ליד beamline מיקרו פוקוס (10 מיקרומטר קוטר) הסובלים mosaicity גדול (מעל 2-3 מעלות), כנראה בשל הצטברות של פגמים גידול גבישים, או מתופעות הקשורות cryocooling. LCP-SFX, לעומת זאת, אפשר לנו לאסוף נתונים עקיפים איכותיים LCLS מ -5 גבישים מיקרומטר בגודל בטמפרטורת חדר. המבנה נפתר על ידי החלפה מולקולרית בבית איזוטרופי 3.4, 3.2 ו ברזולוצית 4.0 Å לאורך שלושת הצירים עיקריים, בבירור זיהוי מיקומו של cyclopamine בכיס 6 מחייב (איור 3).

אופיאטים אלקלואיד, כגון מורפיום, מיקוד קולטן אופיואידים μ (μ-OR) נמצאים בשימוש נרחב עבור ניהול כאבים עזים. עם זאת, השימוש הנרחב שלהם מוביל סובלנות רכש והתמכרות. Co-ממשל של morphines עם קולטן δ-אופיואידים אנטגוניסטים (δ-OR) הוכח כדי למנוע את תופעות הלוואי הנ"ל, ובכך לקדם את החיפוש עבור תרכובות עם פונקציה δ-OR-אנטגוניסט ו μ-OR-אגוניסט מעורבת. השגנו את הנתונים העקיפים הראשוניים על δ-OR בקומפלקס עם דו-תפקודי טטרה-פפטיד DIPP-NH 2 באמצעות גבישי cryocooled כי מתפזרים כדי 3.3 בשעת מקור synchrotron רנטגן העסיק אסטרטגית איסוף נתונים קונבנציונלית מבוסס goniometer. נתונים אלה נחשפו צפיפות אלקטרונים מעורפלת חלקית עבור ליגנד פפטיד. בהמשך לכך, נתונים עקיפים XFEL בטמפרטורת החדר התקבלו והמבנה נקבע על 2.7 ברזולוציה מראה צפיפות ברורה ליגנד לבין הקולטן 7. מבנה זה הציע הזדמנות לתפקוד הקולטן אופיואידים הבנה נוספת סלקטיביות וסיפק תובנות רבות ערך לפיתוח משככי כאבים חדשים.

ge = "1"> אנגיוטנסין II סוג 1 קולטן (AT 1 R) הוא GPCR המשרתים כרגולטור העיקרי של לחץ דם. אנחנו התגבשנו AT 1 R בקומפלקס עם אנטגוניסט ZD7155 ב LCP. גבישים אופטימליים הגיעו לגודל מקסימאלי של 40 × 4 × 4 מיקרומטר 3 עם העקיפה הטובה ביותר להגיע רק ~ 4 A ב מקור synchrotron. על ידי שינוי תנאי התגבשות, השגנו מקלחות של גבישים קטנים יותר (10 × 2 × 2 מיקרומטר 3), אשר שמשו להשיג את המבנה בטמפרטורת חדר על 2.9 ברזולוצית א בעזרת קרינת XFEL. סך של 2,764,739 תמונות גלאים נאספו לבצע במערך שלם מכ 65 μl של LCP קריסטל-לאדן המקביל לכ 0.29 מ"ג של חלבון 9. מתוך המספר הכולל של מסגרות, 457,275 זוהו להיטים קריסטל, מתאים אחוזי הצלחה של 17%, מתוכם 73,130 מסגרות (16% להיטים) צמודות בהצלחה וכן שלבו.

GPCRs אות דרך שני מסלולים עיקריים בתיווך או G חלבונים או arrestins. המבנה של הקולטן β 2 -adrenergic כבול לחלבון של G heterotrimeric נפתר לפני כמה שנים 20, ואילו המבנה של GPCR בקומפלקס עם arrestin נשאר חמקמק. השגנו גבישים קטנים של חלבון היתוך rhodopsin-arrestin ב LCP שהגיע 25-30 מיקרומטר בממד הארוך, אך למרות אופטימיזציה נרחבת, מתפזרים רק ~ 7 ברזולוציה A ב מקורות synchrotron. על ידי שימוש בשיטת LCP-SFX, בתוך 12 שעות של XFEL beamtime, אספנו 22,262 להיטים קריסטל, מתוכם 18,874 דפוסים צמודים בהצלחה משולבת איזוטרופי גבולות ברזולוציה של 3.8 A / 3.8 / 3.3 A 19. Rhodopsin-arrestin הנו קומפלקס חלבון מאוד מאתגר, שהתנגד קביעת מבנה באמצעות גישות מסורתיות. הקביעה המוצלחת של המבנה הזה הוכיחה את הפוטנציאל העצום שלשיטת LCP-SFX כיצד לטפל בבעיות קשות סיפק הזדמנות ייחודית לבחון את מנגנון איתות משוחד arrestin ב GPCRs.

לבסוף, בנוסף קרום גבישי חלבון גדל בשלב lipidic, הכנת המדגם ושיטת המסירה שלנו הותאמה בהצלחה גבישי חלבון מסיס, שבו LCP משמש כמדיום המוביל עבור משלוח של גבישים, מה שמאפשר לנו להקטין את צריכת החלבון דרמטי דרושים לצורך קביעת מבנה. מבנים של שני חלבונים מודל, ליזוזים ו phycocyanin, נפתרו ב 1.89 A ו- 1.75 רזולוציה Å בהתאמה לפי שיטה זו, באמצעות פחות מ -0.1 מ"ג של כל חלבון 21.

סרוטונין קולטן 2B קולטן smoothened אנגיוטנסין II קולטן מסוג 1 Rhodopsin-Arrestin ליזוזים Phycocyanin
PDB מזהה 4NC3 4O9R 4RWD 4YAY 4ZWJ 4ZIX 4ZIZ
* סה"כ בשימוש מדגם, μl 100 83 50 65 75 10 10
סה"כ חלבון המשמש, מיקרוגרם 300 500 300 290 340 100 100
גודל גביש ממוצע, מיקרומטר 5 × 5 × 5 <5 5 × 2 × 2 10 × 2 × 2 5-10 5 × 2 × 2 10 × 10 × 5
אחוזי הצלחה, % 3.6 7.8 5.9 17 0.45 40 6.5
זמן איסוף הנתונים סה"כ, hr 10 8 4.6 6.4 12 0.75 0.67
מספר דפוסים באינדקס 32,819 61,964 36,083 73,130 18,874 54,544 6,629
קבוצת Space C 2 2 2 1 P 2 1 ג 2 ג 2 P 2 1 2 1 2 1 P 4 3 2 1 2 H 3 2
ברזולוציה, 2.8 3.2 / 3.4 / 4.0 2.7 2.9 3.3 / 3.8 / 3.8 1.89 1.75

ge = "1"> * לאחר טיטרציה השומנים

סיכום טבלת 1. הכנת מדגם וסטטיסטיקת איסוף נתונים עבור מבני נציג לפתור באמצעות שיטת LCP-SFX.

כמות המדגם הנדרשת עבור ניסוי LCP-SFX תלויה באיכות עקיפה גביש, צפיפות קריסטל, הקוטר של זרבובית המזרק, כמו גם את גודל קרן XFEL, עוצמת דופק שיעור החזרה.

איור 1
תרשים זרימה באיור 1. הליך הכנת מדגם אופייני LCP-SFX. להכנת דגימות מתחילה עם התגבשות LCP של חלבון המטרה ב מזרקי זכוכית חזק גז. לאחר הגבישים מתקבלים, את LCP-לאדן קריסטל מאוחד מזרק אחד טיטרציה עם שומנים נוספים, כדי absorב הפתרון הנמהר העודף. קריסטלים מאופיינים מכן באמצעות שיטות מיקרוסקופיה שונות לפני איסוף הנתונים XFEL. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2. תוצאת נציג, מבנה 5-HT 2B בקומפלקס עם ארגוטמין. (א) microcrystals של 5-HT 2B / ארגוטמין צילמו באמצעות מצב מיקרוסקופ שדה בהיר 8. נתון זה נעשה שימוש חוזר בחומר עזר 8 עם בעלי זכויות ממדע. (ב) microcrystals של 5-HT 2B / ארגוטמין צלם באמצעות מצב 8 מיקרוסקופ צולב מקוטבת. נתון זה נעשה שימוש חוזר בחומר עזר 8 עם זכויות יוצריםרשות ממדע. (ג) ייצוג קריקטורה של מבנה 2B / ארגוטמין 5-HT שהשיג גישת LCP-SFX. ליפידים שנבנו במודל מוצגים ייצוג מקל. ארגוטמין ליגנד מוצג ייצוג תחומים. קווים מוצקים לציין את גבולות קרום למידע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3. תוצאה נציג, מבנה SMO בקומפלקס עם cyclopamine. בחלונית השמאלית, microcrystals של SMO / cyclopamine צילמו באמצעות מצב מיקרוסקופ צולבות מקוטב 6. נתון זה נעשה שימוש חוזר בחומר עזר 6 עם בעלי זכויות מתקשורת הטבע. פנל מימין, representati קריקטורהעל מבנה SMO / cyclopamine שהשיג גישת LCP-SFX. cyclopamine ליגנד מוצג ייצוג תחומים. קווים מוצקים לציין את גבולות קרום למידע. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

הפרוטוקולים המתוארים כאן מתארים באופן כללי של נוהל הכנת מדגם לניסוי LCP-SFX רגיל עם מזרק LCP. בהתבסס על הניסיון שלנו, את הסכום הכולל של מדגם LCP microcrystal-לאדן הסופי הנדרש לאיסוף בסיס נתונים מלאים הוא בדרך כלל 50-100 μl (טבלת 1; 25-50 μl של מדגם LCP חלבון עמוס ראשוני), בהתאם לגודל microcrystal , איכות וצפיפות. מאז כל 100 מזרק μl גז חזק זכוכית יכול להכיל כ 7 μl של LCP בצורת מחרוזת פרושים עד הסוף כדי להבטיח ראוי ואף דיפוזיה של הפתרון הנמהר לתוך LCP, לפחות ארבעה עד שבע דגימות ב מזרקים צריכות להיות מוכנות כל ניסוי LCP-SFX.

מאז המדגם נמתח דרך מיקרומטר 20-50 צר נימי קוטר, חשוב להימנע מכל חומר חלקיקי זרים במדגם. Dusts ו סיבים שיכולים להיות מוצג מדי פעם LCPפתרונות מדגמים או נמהרים שעלולים לסתום את נימי המזרק ולהגדיל את האמת נחלשה במהלך הניסוי. לכן, חשוב לסנן את השומנים וכל הפתרונים דרך פילטר נקבובי 5 מיקרומטר לפני הכנת דגימות. לחלופין, חדר נקי או ברדס בחדר נייד נקי יכול לשמש להכנת מדגם.

פרוטוקולים אלה מבוססים על שימוש 9.9 MAG (monoolein) כמו השומנים המארחים להתגבשות MP. הם, לעומת זאת, אינם מוגבלים 9.9 MAG וניתן להתאים בקלות לכל שומנים מארחים LCP אחרים או תערובות שומנים לאחר שהובא בחשבון את ההבדלים בהתנהגות שלב השומנים. מרבית המבנים של חברי פרלמנט התגבש LCP התקבלו באמצעות לאחד מהעיתונים, עם 9.9 MAG להיות הנציג המצליח ביותר עד כה 15. החסרון העיקרי של שימוש 9.9 MAG עבור SFX הוא המעבר שלה לשלב גביש שבשבת בקירור מתחת ל -18 מעלות צלזיוס, אשר לעתים קרובות מתרחשת כאשר רכישת הנתונים מתבצעת בחלל ריק. titratiעל עם 7.9 תאר MAG בסעיף 5 של פרוטוקול זה מספק פתרון טוב לבעיה זו. מניסיוננו, קריסטלים לעמוד טיטרציה כזה ללא כל תופעות לוואי. אם, לעומת זאת, התוספת של 7.9 MAG או אחר MAG קצר ב"שרשרת אינה רצויה, טיטרציה יכול להתבצע עם 9.9 MAG. במקרה זה, הגז אשר מייצב את זרימת LCP במהלך ההזרקה לתוך ואקום יש משיטת הליום חנקן, אשר יכול למנוע היווצרות של שלב השומנים גבישי ברוב דגימות, על חשבון בעל זרימת מדגם יציבה פחות.

העקביות דמוית ג'ל של LCP יש יתרון גדול לשימוש כמדיום המוביל קריסטל, שכן הוא מאפשר התאמה של שער זרימת קריסטל על פני מגוון רחב, המתאים איסוף נתוני קריסטלוגרפיה סדרה במקורות XFEL ו synchrotron מודרניות. התאמת קצב הזרימה קריסטל עם תוצאות החזרה הדופקות XFEL ב לירידה דרמטית בצריכת קריסטל לפי סדר הגודל גompared הזרקת נוזל. LCP הוא מדיום מוביל מתאים למסירה לא רק של גבישי MP גדלו בו, אלא גם עבור גבישים של חלבונים מסיסים 21. תקשורת מובילה קריסטל צמיגת מספר חלופית לאחרונה הוכנסה 22 - 24, הרחבת הארסנל של כלים ריאגנטים לביצוע ניסויים קריסטלוגרפיה סדר. יתר על כן, קריסטלוגרפיה סדרה עם LCP כמדיום משלוח קריסטל הודגמה במקורות סינכרוטרון קונבנציונליים, לפחות עבור היטב diffracting גבישי 24,25. שדרוג עתידי של מקורות synchrotron להגביר עוצמת רנטגן לפי סדרי גודל, כמו גם שיפורים בטכנולוגיות גלאי, יגרום קריסטלוגרפיה סדרתי שיטה עוד יותר לנגיש ואטרקטיבי עבור קביעת מבנה.

LCP-SFX הוכיח העצמה שלה לקביעה מבנית MP. עבור מערכות ביולוגיות מאתגרות (כגון GPCRs או מתחמי macromolecular) איפה אניarge, גבישים באיכות עקיפה קשים לגדול, LCP-SFX עשויה לספק אטרקטיבית, אם לא האופציה היחידה, מעשית לפתור מבנה ברזולוציה אטומי. עם כל היתרונות שלה, כלומר, באמצעות LCP כמו מטריקס להתגבשות MP ומסיר קריסטל, צריכת חלבון נמוכה, עדר ניזקי קרינה, איסוף נתונים בטמפרטורת חדר, אפשרויות של מחקרי זמן נפתר 26,27 ואין דרישת קצירת גביש, LCP- SFX צריך לשחק תפקיד חשוב בעתיד של ביולוגיה מבנית.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקים R01 GM108635 ו U54 GM094618, Mayo Clinic-ASU שיתופית זרע גרנט פרס ו- NSF STC הפרס 1231306. אנו מודים א ווקר לסיוע בהכנת כתב היד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Nu Chek Prep M239 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monoolein (9.9 MAG) Sigma M7765  Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid monopalmitolein (9.7 MAG) Nu Chek Prep M219 Hosting lipid for the protein to be crystallized
LCP host lipid 7.9 MAG Avanti Polar Lipids 850534 Hosting lipid for tiration to avoid lamellar crystal phase (Lc) formation during sample injection
Purified protein solution concentrated to 20-50 mg/ml Target protein
Chloroform Fisher Scientific C606-1 Used to dissolve lipids
Methanol Sigma-Aldrich 179337-500ML Used to wash syringes
Eleven 100 μl Hamilton gas-tight syringes without needles Hamilton 7656-01 For LCP preparation
Eight syringe couplers Formulatrix SKU 209526 For LCP preparation
LCP-injector loading needle Hamilton 7804-01 point style 3, length 1 inch For LCP dispensing and injector loading
Removable needle Hamilton 7768-01 For removing precipitant solution
Parafilm M Parafilm PM992 Used for syringe sealing
Lint free lens cleaning tissues Fisher NC9592151
Centrifugal filter tubes, Ultrafree-MC, 0.5 ml, Durapore 5 µm Millipore UFC3 0SV 00 Used for filtering of precipitant solutions and lipids
Microscope slides, 1 inch x 3 inch  GoldSeal 3010
Two wash bottles with fine tips. One filled with milli-Q or distilled water, the other with methanol VWR 89094-640 These are used to clean the syringes, needles and coupler.  Methanol is used first, then water.
Gloves Microflex XC-310-L For blow drying syringes, needles, ferrules, and couplers
Safety glasses
Pressurized air cans Office Depot (Dust-Off) 527494 For syringe cleaning
Dry block heater with a digital temperature controller Fisher 11-720-10BQ  Used for thawing lipids
Benchtop Centrifuge Fisher 05-413-340 Spinning down solutions
Clean Room Mini - 12 inch Portable Positive Pressure Hood with HEPA filter Sentry Air Systems, Inc. SS-112-PCR Cleaning sample preparation
Stereo zoom microscope equipped with a linear polarizer and rotating analyzer  Nikon SMZ1500 Crystal density check
UV microscope JAN Scientific UVEX-P Optional, for crystal imaging purposes
SHG imager Formulatrix SONICC Optional, for crystal imaging purposes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cherezov, V., et al. High-resolution crystal structure of an engineered human beta2-adrenergic G protein-coupled receptor. Science. 318 (5854), 1258-1265 (2007).
  2. Cherezov, V. Lipidic cubic phase technologies for membrane protein structural studies. Curr Opin Struc Biol. 21 (4), 559-566 (2011).
  3. Chapman, H. N., et al. Femtosecond X-ray protein nanocrystallography. Nature. 470 (7332), 73-77 (2011).
  4. Neutze, R., Wouts, R., van der Spoel, D., Weckert, E., Hajdu, J. Potential for biomolecular imaging with femtosecond X-ray pulses. Nature. 406 (6797), 752-757 (2000).
  5. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. J Phys D Appl Phys. 41 (19), 195505 (2008).
  6. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nat Commun. 5, 3309 (2014).
  7. Fenalti, G., et al. Structural basis for bifunctional peptide recognition at human δ-opioid receptor. Nat Strcut Mol Biol. 22 (3), 265-268 (2015).
  8. Liu, W., et al. Serial femtosecond crystallography of G protein-coupled receptors. Science. 342 (6165), 1521-1524 (2013).
  9. Zhang, H., et al. Structure of the Angiotensin Receptor Revealed by Serial Femtosecond Crystallography. Cell. 161 (4), 833-844 (2015).
  10. Liu, W., Ishchenko, A., Cherezov, V. Preparation of microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Nat Protoc. 9 (9), 2123-2134 (2014).
  11. Liu, W., et al. Structural basis for allosteric regulation of GPCRs by sodium ions. Science. 337 (6091), 232-236 (2012).
  12. Caffrey, M., Cherezov, V. Crystallizing membrane proteins using lipidic mesophases. Nat Protoc. 4 (5), 706-731 (2009).
  13. Liu, W., Cherezov, V. Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases. J Vis Exp. (49), (2011).
  14. Li, D., Shah, S. T. A., Caffrey, M. Host Lipid and Temperature as Important Screening Variables for Crystallizing Integral Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. Trials with Diacylglycerol Kinase. Cryst Growth Des. 13 (7), 2846-2857 (2013).
  15. Caffrey, M., Lyons, J., Smyth, T., Hart, D. J. Monoacylglycerols: The Workhorse Lipids for Crystallizing Membrane Proteins in Mesophases. Current Topics in Membranes. 63, Elsevier. (2009).
  16. Kulkarni, C. V., Wachter, W., Iglesias-Salto, G., Engelskirchen, S., Ahualli, S. Monoolein: a magic lipid? Phys Chem Chem Phys. 13 (8), 3004-3021 (2011).
  17. Kissick, D. J., Gualtieri, E. J., Simpson, G. J., Cherezov, V. Nonlinear optical imaging of integral membrane protein crystals in lipidic mesophases. Anal Chem. 82 (2), 491-497 (2010).
  18. James, D. Injection Methods and Instrumentation for Serial X-ray Free Electron Laser Experiments. , Arizona State University. 1-126 (2015).
  19. Kang, Y., et al. Crystal structure of rhodopsin bound to arrestin by femtosecond X-ray laser. Nature. 523 (7562), 561-567 (2015).
  20. Rasmussen, S. G. F., et al. Crystal structure of the β2 adrenergic receptor-Gs protein complex. Nature. 477 (7366), 549-555 (2011).
  21. Fromme, R., et al. Serial femtosecond crystallography of soluble proteins in lipidic cubic phase. IUCrJ. 2 (Pt 5), 545-551 (2015).
  22. Sugahara, M., et al. Grease matrix as a versatile carrier of proteins for serial crystallography. Nat Meth. 12 (1), 61-63 (2014).
  23. Conrad, C. E., et al. A novel inert crystal delivery medium for serial femtosecond crystallography. IUCrJ. 2 (Pt 4), 421-430 (2015).
  24. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallogr Sct D. 71 (Pt 2), 387-397 (2015).
  25. Nogly, P., et al. Lipidic cubic phase serial millisecond crystallography using synchrotron radiation. IUCrJ. 2, 168-176 (2015).
  26. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  27. Kupitz, C., Basu, S., Grotjohann, I., Fromme, R. Serial time-resolved crystallography of photosystem II using a femtosecond X-ray laser. Nature. 513, 261-265 (2014).

Tags

ביוכימיה גיליון 115 קריסטלוגרפיה femtosecond סדרתי ביוכימיה רנטגן לייזר אלקטרונים חופשיים השלב מעוקב lipidic הביולוגיה המבנית חלבון הממברנה משלוח מדגם קולטן המצומד לחלבון G
הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. … More

Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography. J. Vis. Exp. (115), e54463, doi:10.3791/54463 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter