A detailed protocol describing the SSTD NMR method is presented here to help new users apply this new method to obtain the kinetic parameters of their own systems undergoing chemical exchange.
この詳細なプロトコールは、最近、従来の方法によって分析することが困難な相互サイトの化学交換の過程を研究するために、当社グループで開発された新しいスピン飽和移動差核磁気共鳴プロトコル(SSTD NMR)を、説明します。名前が示すように、この方法では、ビルド(飽和時間を増加さに沿って過渡スピン飽和移動を測定することにより、飽和移動差タンパク質 – リガンド相互作用の研究のために用いられる(STD)NMR法を用いて、小分子のために使用されるスピン飽和移動方法を組み合わせ化学交換を受けて、小さな有機および有機金属分子で-up曲線)。
既存のものの上に、この方法の利点は次のとおりです。交換信号の合体に到達する必要はありません。この方法であれば交換部位の一方の信号が分離されているように適用することができます。 T 1を測定したり、定常状態の飽和に到達する必要はありません。速度定数v梅毒は、直接測定され、T 1の値は、実験の唯一のセットを使用して、同じ実験で得られます。
メソッドをテストするために、我々は多くのデータを比較するために提供されているN、N個の -dimethylamidesの束縛回転のダイナミクスを研究しています。 SSTDを用いて得られた熱力学的パラメーターは、報告されたもの(スピン飽和移動技術及び線状分析)と非常に類似しています。この方法は、従来の方法によって研究することができない多くの困難な基材に適用することができます。
私たちは、簡単な実験を設定することを想定し、基板の多種多様にする方法の広い適用は、このNMRにおける豊富な専門知識のない有機および有機金属化学者の間で一般的な技術になります。
化学交換は、一般的に、核がNMRパラメータ(化学シフト、スカラーカップリング、双極子カップリング、緩和速度)が異なっている別の環境から移動する任意の分子間または分子内のプロセスを指します。多数の有機および有機金属分子で化学交換の例(ビアリールで例えば、回転障壁、リングの障壁と立体配座平衡をひっくり返す、窒素反転、リガンド結合、縮退した配位子交換及び互変異性)があります。1-3化学交換レートが関連するに交換プロセスの障壁の熱力学ため、その研究は、これらの系の分子動力学を理解するために決定的に重要です。
NMRでの動的交換の古典的な兆候は、温度変化などのNMR信号のライン形状の劇的な変化です。低い温度では、プロセスは遅く、二つの異なる化学シフトobserありますVED。高い温度では、2つの信号は、「合体」として知られている一つの信号、合流します。中間温度では、信号が非常に広いとなります。化学交換にNMRスペクトルのこの感度は、NMR溶液中の分子のダイナミクスを研究するための非常に強力な方法になります。二つの方法は、主に、溶液中の動的プロセスの研究に用いられてきた:4-7、ライン状の分析をし、スピン飽和移動実験8-9のほかに、それはまた、反転転送方法10とのためのCIFITプログラム11を言及する価値があります単純なシステムでの交換測定のための比較的効率的なアプローチである速度定数の直接抽出。これらの方法は、ほとんどの場合、非常に良好な結果を与えるが、それらは、しかしながら、多くの欠点を有しています。線状分析の主な欠点は、いくつかのサンプルで合体に到達するのに必要な高温である。12 CA考慮すべき主な問題アウトrryingスピン飽和移動実験は、次のとおり交換部位の間の定常状態の飽和移動に到達するために必要な非常に長い飽和時間、困難であることができる一定の縦緩和時間T 1を決定する必要性が、異なるの重なりがある場合に研究の領域における信号。13
有機金属機構における我々の調査の一環として、14-16私たちのグループは、溶液中の白金-アレン錯体の流動挙動を検討しています。これは、少なくとも3つの異なるプロセス、アレン軸の1の周りに金属のπ-顔交換又は回転され、それらのいずれかを含む複雑な作業です。私たちは、の合一温度を作った私たちの白金-アレン錯体中の非常に遅い回転に起因し、17-19は、私たちの研究に適していなかった、通常のVT実験と同様のシステムで以前に使用されてきたライン状の解析技術ことを検出しましたSIG錯体の分解温度よりも高い興味のあるのNAL。
この制限を克服するために、我々が開発し、最近相互サイトの化学交換の過程を研究するための新しいNMRプロトコル(SSTD NMR)を報告した。20名がこの方法を用いて、小分子のために使用されるスピン飽和移動方法を組み合わせ通り飽和移動差NMR法は、化学交換を受けている小分子で飽和時間(ビルドアップ曲線)を増加させるに沿って過渡スピン飽和移動を測定することによって、タンパク質-リガンド相互作用の研究、21-24のために使用します。
この新しい方法(SSTD NMR)で私たちは、伝統的なアプローチを超えるいくつかの追加の利点を持つ小さな有機および有機金属分子における分子内化学交換の動力学的パラメーターを得ることができることを示している:信号の合体が必要とされていないので、より柔軟な温度範囲をに使える研究では、交換共振の少なくとも一つは分離する必要がありますが、信号のオーバーラップは、干渉しません。 T 1を測定したり、定常状態の飽和に到達する必要はありません。速度定数の値は、直接測定され、T 1の値は、実験の唯一のセットを使用して、同じ実験で得られます。 SSTD NMR方法の別の顕著な利点は、分析を線形とは対照的に、動力学的速度定数の決意を高磁場に関連付けられた凝集温度の上昇によって制限されない、ということです。したがって、私たちの方法論は、その後、非常によく、低および高磁場の両方のために充当されます。この記事は、新しいユーザーが化学交換を受けて自分のシステムにこの新しい方法を適用して、試料調製、実験のセットアップ、データ収集、および単純な有機分子におけるデータ処理および分析の例を説明するためのものです。
One of the more obvious advantages of this methodology is that the rate constants and the relaxation time for a given temperature can be obtained with a single set of experiments, with a robust pulse sequence (the same used for STD experiments to study protein-ligand interactions, which is typically found within the available set of experiments from the spectrometer manufacturer). This simplifies the experimental setup since there is no need to measure T1 or reach steady state saturation. Besides, it is remarkable that this method does not depend on the magnet strength, as coalescence methods. On the other hand, the main limitation is that this technique cannot be applied to chemical exchange processes too fast or too slow, which would depend on the temperature range of the NMR machine or the solvents used.
This new technique for the calculation of kinetic parameters can be applied to a great variety of substrates and its applicability has already been demonstrated with some interesting molecules.21 The kinetic parameters of the 4-N,N-dimethylamido[2.2]paracyclophane, a challenging substrate in which the signal of one of the methyl groups of interest is overlapped with other signals from the molecule, were successfully calculated using SSTD NMR. Interestingly, this methodology can be applied as long as one of the signals of study is isolated. SSTD NMR is also a useful protocol for the calculation of kinetic parameters in molecules in which the coalescence temperature is so high that the molecule decomposes before reaching it. This is the case with PtCl2(dimethylallene)(pyridine), in which the methodology was successfully applied without the need of reaching coalescence. The choice of solvents and temperatures is critical to obtain good results, since the chemical exchange rates can vary significantly with these parameters. Moreover, in addition to the criteria in a normal NMR experiment, key steps in a SSTD NMR experiment are the selectivity of the irradiation as well as the temperature control. Both factors have to be precise to guarantee the success of the experiment.
The representative results presented here are for the kinetics of intramolecular chemical exchange, but the technique can also be applied to study the kinetics of intermolecular chemical exchange and also ligand exchange, common processes in the dynamic behavior of transition metal complexes.
Finally, providing a proper modification of the equations is made,32 this method could be extended to deal with multi-site exchange and unequal populations, as it has been done in former double resonance experiments,8-9 increasing the usefulness of this technique for the study of chemical exchange processes in challenging compounds.
The authors have nothing to disclose.
Funding by the University of East Anglia, the EPSRC (EP/L012855/1) and the EU (H2020-MSCA-IF-2014-EF-ST-658172) is gratefully acknowledged (MTQ).
N,N-dimethylacetamide | Aldrich | 38840 | Acute toxicity |
Toluene-d8 | Fluorochem | D-005 | Flammable and toxic |
500MHz 7" Select Series NMR Tubes | GPE LTD | S-5-500-7 | |
TopSpin 2.1 | TopSpin program, Bruker Corp., http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin/ (2015). | ||
Origin 6.0 | Origin 6.0 software, OriginLab Corp., http://originlab.com. | ||
Bruker Avance III 500 MHz fitted with 5mm broadband observed BBFOplus Z-gradient SmartProbeTM probe | Bruker Corp., http://www.bruker.com | ||
Bruker Avance I 500 MHz Inverse Triple Resonance NMR spectrometer fitted with a 5mm TXI Z-gradient probe | Bruker Corp., http://www.bruker.com | ||
Ceramic Spinner standardbore shimsystems (5 mm) | Bruker Corp., http://www.bruker.com | H00804 |