We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
Brillouin ljusspridning (BLS) effekt upptäcktes av Léon Brillouin i 1922. 1 Den består av oelastiska spridning av synligt ljus genom termiskt aktiverade akustiska fononer i ett material. I fasta tillståndets fysik, akustiska fononer är sammanhängande vibrationer i alla atomer i ett galler. En endimensionell kedja av två alternerande typer av atomer i ett gitter är en enkel modell som illustrerar skillnaden mellan akustiska fononer avslöjade av BLS och optiska fononer, sonderas av IR-absorption och Ramanspridning (Figur 1). Akustiska fononer är i fas rörelser atomer i kedjan med en förflyttning längs utbredningsriktningen (längsgående akustiska fononer) eller vinkelrätt mot utbredningsriktningen (tvärgående akustiska fononer), medan optiska fononer är out-of-fas rörelser atomerna producerar en oscillerande elektrisk dipolmoment (längsgående eller tvärgående lägen).
BLS spectroscopy har använts i analytisk vetenskap sedan 1920-talet; dock endast sedan 1980-talet har höga mätningar kontrast varit möjligt genom användningen av tandem multipass Fabry-Perot-spektrometer. Sedan dess har ett ökande antal framsteg i BLS för analytiska applikationer i kondenserade materiens (där foton fonon växelverkan utnyttjas) 2-4 och magnetiska material (genom foton Magnon interaktion) 5 har åstadkommits. Seminal verk om biomedicinska tillämpningar 6-8 har banat väg för utvecklingen av olika metoder, bland annat den som gäller här och en tidigare beskrivits 9 med en reflekterande substrat i en plattliknande konfiguration för att uppnå fullständig beskrivning av elasticitet tensor av ett prov.
I detta arbete, vi tillämpar BLS spektroskopi för att de grundläggande beståndsdelarna i den extracellulära matrisen i bindväv, de fibrösa proteinerna elastin och typ I-kollagen. TYP I-kollagen är en stel, trippel spiral molekyl som monterar i sidled och längdled med omfattande tvärbindning för att bilda väsentligen stela fibrer i vävnader såsom senor. Nätverk av kollagen ofta samexistera med nätverk av elastin, ett protein som, ovanligt, genererar långväga elasticitet genom en kombination av entropi och hydrofoba interaktioner med sin omgivning och är avgörande för funktioner vävnader, såsom lunga och hud. Båda fibrer modelleras med hjälp av en hexagonal kristallmodell i aktuell forskning. 9 I del 1, beskriver vi protokoll för att extrahera fibrer från djurvävnader och för att förbereda provet för mätningarna spektroskopiska. I del 2, är proceduren för att ställa in Brillouin apparaten och förvärva spektra från fibrerna presenteras. Del 3 ger information om dataanalys som appliceras på Brillouin spektra för att extrahera relevant mekanisk informationen däri. Då, är representativa resultat presenteras och discussed.
Brillouinspridning spektroskopi är ett unikt verktyg med vilket de individuella komponenterna i elasticiteten tensor av ett protein fiber kan karakteriseras på oöverträffad detaljrikedom. Vidare kan mätningar utföras på en mikroskopisk skala och därmed kommer att ge oss nya insikter i mikroskala mekanik biologiska strukturer, tillåter oss, för första gången, för att förstå den mekaniska och förmodligen funktionella, betydelsen av komplexiteten i matrisarkitektur och biokemi som har avslöjats på senare år.
Tekniken mäter mekaniska egenskaper i en GHz. Den här domänen har aldrig undersökts tidigare för strukturella biopolymerer och det både höjer och ger möjlighet att svara på grundläggande frågor om molekylära mekanismer av elasticitet.
Vi beskrev stegen för att extrahera kollagen och elastin fibrer från djurvävnader och för att mäta Brillouin scattering spektra med hjälp av ett reflekterande substrat för att uppnå fullständig beskrivning av fiber biomekanik. Kritiska steg i protokollet är de som säkerställer att renade fibrer erhålls och lämpliga experimentella betingelser är på plats för reproducerbara mätningar av fibrösa proteiner. Det måste emellertid hållas i minnet att de extraktionsmetoder kan modifiera de mekaniska egenskaperna hos fibrerna.
Modifieringar av tekniken innebär kopplingen med optisk mikroskopi för microfocused Brillouin spridning och kartläggning närmar 13 och eventuell kombination med kompletterande metoder (t.ex. Raman-spridning). Nuvarande tillämpningar av tekniken är främst inriktade på utskurna biologiska material, men viktiga händelser, till exempel de som baseras på flera Vipa etalons 14, gör det möjligt att översättningen av denna teknik från bänk till sängen med en rad tillämpningar redan demonstrated 15,16 inklusive potential in vivo applikationer. Den VIPA tillvägagångssätt är ett alternativ till vad vi beskriva; Det har snabbare förvärv tid men är inte nödvändigtvis lämpligt när det gäller ogenomskinliga prover såsom de analyseras här. Dessutom är användningen av en reflekterande substrat inte praktiskt i uppställningar som använder Vipa etalons eftersom deras kontrast inte skulle vara tillräcklig för att avvisa kvasi-elastisk ljus. Begränsningar i samband med hastigheten för förvärv av en spektral dataset och den inneboende svaga spridningstvärsnittet av materialet kan begränsa ansökningar till dynamiska biologiska system och till förvärvet av data från djupt inom vävnader, men tekniska finesser kan förbättra nuvarande prestanda.
BLS ser ut att bli ett viktigt verktyg i grundläggande biofysikalisk forskning på den extracellulära matrisen och därigenom ta fram nya insikter om utvecklingen av mekaniska egenskaper under matris tillväxt och deras förlust i patologiskadegeneration. Det är dock viktigt att komma ihåg att mätningarna är icke-invasiv och kan därför ske in vivo. Faktum är att det har redan gjorts i hornhinnan 16 och sådant arbete kan ge en plattform för utveckling av nya diagnostiska verktyg för ett brett spektrum av bindväv.
Ultraljud elastografi och atomkraftsmikroskopi (AFM) finns alternativa metoder för mikromekaniska mätning, men BLS tekniken ger bättre spatial upplösning (på en subcellulär skala) än den förra och, till skillnad från AFM, medför inga mekaniska krafter på provet och är inte begränsad till analysen endast av ytsärdrag. Brillouin moduler av kollagen och elastin är i GPa intervallet, medan Youngs moduler från makroskopiska stammar är i storleksordningen MPa (ytterligare detaljer kommer att redovisas någon annanstans). Detta resultat indikerar en differentiell elasticitetsmodul med ett starkt beroende av exciteringsfrekvensen, på grund avdet viskoelastiska beteendet hos fibrerna. BLS kan tillämpas på ett brett spektrum av problem och material i biomedicinsk vetenskap. Det kan bidra till att svara på frågor om fysiologi och patologi biologiska vävnader, samt ge en fysisk verktyg för den grundläggande förståelsen av material och interaktioner på molekylär nivå.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
Euthatal | Merial | J01601A | |
Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
Freezer | Lec | TU55144 | |
Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
Beaker | VWR | 213-0469 | |
Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |