We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
Brillouin-lysspredning (BLS) virkning blev opdaget af Léon Brillouin i 1922. 1 Den består af uelastisk spredning af synligt lys ved termisk aktiverede akustiske fononer i et materiale. I faststoffysik, akustiske fononer er sammenhængende vibrationer af alle atomer i et gitter. En endimensional kæde af to skiftende typer af atomer i et gitter er en simpel model, der illustrerer forskellen mellem akustiske fononer, afsløret af BLS og optiske fononer, probet ved IR absorption og Raman-spredning (figur 1). Akustiske fononer er i fase bevægelser af atomer i kæden med en forskydning langs retningen af formering (langsgående akustiske fononer) eller vinkelret på udbredelsesretningen (tværgående akustiske fononer), mens optiske fononer er ud-af-fase bevægelser af atomerne producerer et oscillerende elektrisk dipolmoment (langsgående eller tværgående tilstande).
BLS Spectroscopy har været anvendt i analytisk videnskab siden 1920'erne; dog kun siden 1980'erne har høj kontrast målinger været muligt ved anvendelse af tandem multipass Fabry-Perot spektrometer. Siden da et stigende antal af forskud i BLS til analytiske applikationer i faste stoffer (hvor foton-phonon interaktion udnyttes) 2-4 og magnetiske materialer (gennem foton-Magnon interaktion) 5 er blevet bragt om. Skelsættende værker om biomedicinske anvendelser 6-8 har banet vej til udvikling af forskellige tilgange, herunder den anvendte her og den tidligere beskrevne 9 ved hjælp af en reflekterende substrat i en trombocyt-lignende konfiguration til at opnå den fulde beskrivelse af elasticitet tensor af en prøve.
I det foreliggende arbejde, anvender vi BLS spektroskopi til de grundlæggende bestanddele af den ekstracellulære matrix i bindevæv, de fibrøse proteiner elastin og type I-collagen. Type I collagen er et stift, tredobbelt spiralformet molekyle, som samler tværs og på langs med omfattende tværbinding til dannelse i det væsentlige stive fibre i væv, såsom sener. Netværk af kollagen ofte sameksistere med netværk af elastin, et protein, der, usædvanligt, genererer langtrækkende elasticitet gennem en kombination af entropi og hydrofobe interaktioner med sine omgivelser og er afgørende for de funktioner af væv, såsom lunge og hud. Begge fibre er modelleret ved hjælp af en sekskantet krystal model i den aktuelle forskning. 9 I del 1 beskriver vi protokollen til at udtrække fibrene fra animalske væv og forberede prøven til spektroskopiske målinger. I del 2 er proceduren for opsætning af Brillouin apparat og erhverve spektre fra fibrene præsenteret. Del 3 indeholder oplysninger om dataanalyse anvendes på Brillouin spektre at udtrække de relevante mekaniske oplysningerne heri. Derefter er repræsentative resultater præsenteres og discussed.
Brillouin spredning spektroskopi er et unikt værktøj, hvormed de enkelte komponenter i elasticiteten tensor af et protein fiber kan karakteriseres i hidtil uset detalje. Desuden kan målingerne foretages på en mikroskopisk skala, og dermed vil give os nye indsigter i de mikro-skala mekanik biologiske strukturer, så vi for første gang, for at forstå de mekaniske, og sandsynligvis funktionel, betydning af kompleksiteten i matrix arkitektur og biokemi som er blevet afsløret i de senere år.
Teknikken måler mekaniske egenskaber i en GHz frekvensområdet. Dette domæne er aldrig blevet undersøgt før for strukturelle biopolymerer og det både hæver og tilvejebringer midlet til at besvare fundamentale spørgsmål om molekylære mekanismer i elasticitet.
Vi beskrev de skridt til at udtrække kollagen og elastin fibre fra animalske væv og til at måle Brillouin scattering spektre ved hjælp af en reflekterende underlag for at opnå den fulde beskrivelse af fiber biomekanik. Kritiske trin i protokollen, er dem, der sikrer, at der opnås oprensede fibre og passende eksperimentelle betingelser er til stede for reproducerbare målinger af de fibrøse proteiner. Dog skal det erindres, at de ekstraktionsprocedurer kan ændre de mekaniske egenskaber af fibrene.
Modifikationer af teknikken involverer kobling med optisk mikroskopi for microfocused Brillouin spredning og kortlægning tilgange 13 og den mulige kombination med komplementære teknikker (fx Raman-spredning). Aktuelle anvendelser af teknikken er hovedsagelig fokuseret på udskårne biologiske materialer, men vigtige udviklinger, f.eks dem, der bygger på flere VIPA etaloner 14, gør det muligt at oversættelsen af denne teknik fra stationære til sengen med en række applikationer, der allerede dæmonstrated 15,16 herunder potentiale in vivo-applikationer. Den VIPA tilgang er et alternativ til det, vi beskrive; det har hurtigere erhvervelse tid, men ikke nødvendigvis er hensigtsmæssig i tilfælde af uigennemsigtige prøver såsom de her analyserede. Endvidere er anvendelsen af et reflekterende substrat er ikke praktisk i set-ups, der bruger VIPA etaloner fordi deres kontrast ikke ville være tilstrækkeligt til at afvise kvasi-elastisk lys. Begrænsninger i forbindelse med hastigheden af erhvervelse af en spektral datasæt og i sagens natur svage spredning tværsnit af materialet kan begrænse ansøgninger til dynamiske biologiske systemer og til erhvervelse af data fra dybt i væv, men tekniske raffinementer kan forbedre nuværende resultater.
BLS tegner til at blive et vigtigt redskab i fundamental biofysisk forskning i den ekstracellulære matrix og derved at frembringe nye indsigter i udviklingen af mekaniske egenskaber under matrix vækst og deres tab i patologiskedegeneration. Det er dog vigtigt at huske, at målingerne er noninvasive og kunne derfor blive gennemført in vivo. Faktisk har denne allerede er opnået i hornhinden 16 og dette arbejde kan udgøre en platform for udvikling af nye diagnostiske værktøjer til en bred vifte af bindevæv.
Ultralyd elastografi og atomic force mikroskopi (AFM) er alternative metoder til mikromekanisk måling, men BLS teknik giver bedre rumlig opløsning (på en subcellulære skala) end den tidligere og i modsætning AFM, pålægger ingen mekaniske kræfter på prøven, og er ikke begrænset til analysen kun af overfladetræk. Brillouin moduli af kollagen og elastin er i GPa interval, mens Youngs moduli fra makroskopiske stammer er af størrelsesordenen MPa (yderligere detaljer vil blive rapporteret andetsteds). Dette resultat indikerer en differentiel elasticitetsmodul med en stærk afhængighed af ekscitationsfrekvens på grund afden viskoelastiske opførsel af fibrene. BLS kan anvendes på en lang række problemer og materialer i biomedicinsk videnskab. Det kan hjælpe med at besvare spørgsmål om fysiologi og patologi af biologiske væv, samt give et fysisk redskab til grundlæggende forståelse af materialer og interaktioner på det molekylære niveau.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
Euthatal | Merial | J01601A | |
Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
Freezer | Lec | TU55144 | |
Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
Beaker | VWR | 213-0469 | |
Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |