We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
Brillouin lysspredning (BLS) virkning ble oppdaget av Léon Brillouin i 1922. 1. Det består av uelastisk spredning av synlig lys ved termisk aktiverte akustiske fononer i et materiale. I materialfysikk, akustiske fononer er koherente vibrasjoner av alle atomer i et gitter. En en-dimensjonal kjede av to vekslende typer av atomene i et gitter er en enkel modell som illustrerer forskjellen mellom akustiske fononer, åpenbart av BLS og optiske fononer, probet med IR-absorpsjon og Raman-spredning (figur 1). Akustiske fononer er i-fase-bevegelse av atomer i kjeden med en forskyvning langs forplantningsretningen (langsgående akustiske fononer) eller vinkelrett på forplantningsretningen (tver akustiske fononer), mens optiske fononer er ut-av-fase bevegelse av atomene produsere en oscillerende elektrisk dipolmoment (langsgående eller tverrgående modus).
BLS spektrokopi har vært brukt i analytiske vitenskap siden 1920-tallet; imidlertid kun siden 1980-årene har høy kontrast målinger vært mulig ved bruk av den multipass tandem Fabry-Perot-spektrometer. Siden da stadig flere fremskritt i BLS for analytiske applikasjoner i kondensert materie (der fotonet-Phonon interaksjon blir utnyttet) 2-4 og magnetiske materialer (gjennom foton-Magnon interaksjon) 5 har blitt ført. Brytende arbeider på biomedisinske anvendelser 6-8 har banet vei til utvikling av forskjellige framgangsmåter, inkludert den som anvendes her, og det som er beskrevet tidligere 9 ved hjelp av et reflekterende substrat i en plateliknende form for å oppnå den fullstendige beskrivelsen av elastisiteten av tensor en prøve.
I dette arbeidet bruker vi BLS-spektroskopi til de grunnleggende bestanddeler av den ekstracellulære matrise i bindevev, fibrøse proteiner elastin og type I-kollagen. Type I kollagen er en stiv, trippel skruelinjeformet molekyl som setter sammen sideveis og i lengderetningen med utstrakt tverrbinding for å danne i det vesentlige stive fibre i vev så som sener. Nettverk av kollagen ofte sameksistere med nettverk av elastin, et protein som uvanlig, genererer lang elastisitet gjennom en kombinasjon av entropi og hydrofobe interaksjoner med omgivelsene og er avgjørende for funksjonene til vev som lunge og hud. Begge fibrene blir modellert ved hjelp av en sekskantet krystall modell i den pågående forskning. 9 I en del beskriver vi protokollen for å trekke ut fibrene fra animalsk vev og for å forberede prøven for spektroskopiske målinger. I del 2, er prosedyren for å sette opp Brillouin apparater og anskaffe spektra fra fibrene presentert. Del 3 gir detaljer om dataanalyse anvendt på Brillouin spektra å trekke ut relevant mekanisk informasjonen som finnes der. Deretter blir representative resultatene presentert og discussed.
Brillouin-spredning spektroskopi er et unikt verktøy ved hvilken de enkelte komponentene av elastisiteten tensor av et protein fiber kan karakteriseres på enestående detalj. Videre kan målingene utføres på en mikroskopisk skala og derved vil gi oss ny innsikt i mikro-skala mekanikken av biologiske strukturer, slik at vi for første gang, for å forstå den mekaniske, og sannsynligvis funksjonelle betydning av kompleksiteten i matrisen arkitektur og biokjemi som har blitt avslørt de siste årene.
Teknikken måler mekaniske egenskaper i en GHz frekvensområdet. Dette domenet har aldri vært utforsket før for strukturelle biopolymerer og det både øker og gir mulighet til å svare på grunnleggende spørsmål om molekylære mekanismer av elastisitet.
Vi beskrev fremgangsmåten for å trekke kollagen og elastin fiber fra animalsk vev og å måle Brillouin scattering spektra ved bruk av et reflekterende substrat for å oppnå en fullstendig beskrivelse av fiber biomekanikk. Kritiske trinnene i protokollen, er de som sikrer at rensede fibre erholdes og egnede eksperimentelle forhold er på plass for reproduserbare målinger av den fibrøse proteiner. Det må imidlertid tas i betraktning at ekstraksjonsmetoder kan modifisere de mekaniske egenskaper for fibrene.
Modifikasjoner av den teknikk som involverer kobling med optisk mikroskopi for microfocused Brillouin-spredning og kartlegging nærmer seg 13, og den mulige kombinasjon med komplementære teknikker (f.eks Raman-spredning). Aktuelle anvendelser av teknikken er i hovedsak fokusert på utskårende biologisk materiale, men viktige utviklingstrekk, for eksempel de som er basert på flere Vipa etalons 14, gjør mulig oversettelse av denne teknikken fra den stasjonære maskiner til sengen med en rekke applikasjoner allerede demonstrated 15,16 inkludert potensial in vivo applikasjoner. Den VIPA tilnærmingen er et alternativ til det vi beskriver; den har raskere innhentingstiden, men er ikke nødvendigvis er hensiktsmessig i tilfelle av ugjennomsiktig prøver slik som de som analyseres her. Dessuten er bruken av et reflekterende substrat ikke er praktisk i oppsett som benytter VIPA etalons fordi deres derimot ikke ville være tilstrekkelig til å avvise den kvasi-elastisk lys. Begrensninger knyttet til hastigheten på kjøpet av en spektral datasett og iboende svake spredning tverrsnitt av materialet kan begrense programmer til dynamiske biologiske systemer, og til kjøp av data fra dypt inne vev, men tekniske finesser kan forbedre på nåværende ytelse.
BLS lover å være et viktig verktøy i fundamental biofysiske forskning på ekstracellulære matrise og dermed til å produsere ny innsikt i utviklingen av mekaniske egenskaper under matrise vekst og deres tap i patologiskdegenerasjon. Det er imidlertid viktig å huske på at målingene er ikke-invasiv og kan derfor bli foretatt in vivo. Faktisk er dette allerede er oppnådd i hornhinnen 16 og slikt arbeid kan tilveiebringe en plattform for utvikling av nye diagnostiske verktøy for et bredt spekter av bindevevssykdommer.
Ultralyd elastography og atomkraftmikroskopi (AFM) finnes alternative metoder for mikromekanisk måling, men BLS teknikken gir bedre romlig oppløsning (på en subcellulære skala) enn den førstnevnte, og, i motsetning til AFM, stiller ingen mekaniske krefter på prøven, og er ikke begrenset til analysen eneste av overflatetrekk. Brillouin-moduler kollagen og elastin er i GPa rekkevidde, mens Youngs moduler fra makroskopiske stammer er i størrelsesorden MPa (ytterligere detaljer vil bli rapportert andre steder). Dette resultatet indikerer en differensialelastisitetsmodul med en sterk avhengighet av eksiteringsfrekvensen, på grunnden viskoelastiske oppførsel av fibrene. BLS kan brukes på en lang rekke problemer og materialer i biomedisinsk forskning. Det kan hjelpe i å svare på spørsmål om fysiologi og patologi av biologiske vev, samt gi et fysisk verktøy for grunnleggende forståelse av materialer og samhandling på molekylært nivå.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
Euthatal | Merial | J01601A | |
Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
Freezer | Lec | TU55144 | |
Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
Beaker | VWR | 213-0469 | |
Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |