We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
布里渊光散射(BLS)的作用被列昂布里渊于1922年1它包括通过在材料热活化的声学声子的可见光的非弹性散射的发现。在固体物理学,声子在晶格所有原子相干振动。两个交替类型的晶格原子的一维链是表示声学声子,由BLS揭示和光学声子,通过IR吸收和拉曼散射( 图1)探测之间的差的简单模型。声学声子是同相在链中具有沿传播方向的位移的原子移动(纵向声子),或垂直于传播方向(横声子),而光学声子是原子外的相位变动产生振荡电偶极矩(纵向或横向模式)。
BLS分光镜检查已自1920年以来分析科学被使用;然而,仅80年代以来有高对比度的测量通过使用串联多通路法布里 – 珀罗分光计是不可能的。自那时以来,越来越多的进步在BLS在凝聚态物质(其中光子-光子相互作用被利用)分析应用2-4和磁性材料(通过光子磁振子相互作用)5已经带来的。上的生物医学应用6-8开创性工作铺平到的各种方法的发展途径,其中包括一个在这里施加并且在片状结构使用反射衬底实现的弹性张量的完整描述前面所述9所述一个一个样品。
在目前的工作中,我们应用BLS光谱外基质的结缔组织的基本成分,纤维蛋白弹性蛋白和I型胶原。 ŧYPE I型胶原是刚性的,三螺旋分子,其横向和纵向组装具有广泛的交联,以形成组织中基本刚性纤维,例如筋。胶原的网络通常具有弹性的网络并存,一个蛋白,其,异常,通过熵和与其环境的疏水性相互作用的组合产生长范围的弹性,并且是组织如肺和皮肤的功能是必不可少的。两种纤维在当前研究使用六方晶系模型建模。9在部分1,我们描述了协议来提取从动物组织的纤维和以制备用于光谱测量的样品。在部分2,用于设置的布里渊装置和获得从纤维光谱的程序提出。部分3给出施加到的布里渊频谱,提取包含在其中的相关的机械信息的数据分析的细节。然后,代表性的结果都和discusseð。
布里渊散射光谱是一个独特的工具,通过该蛋白纤维的弹性张量的各个组件可被表征在前所未有的细节。此外,该测量可以在微观尺度进行,从而将提供给我们新的见解的生物结构的微观尺度力学,允许我们,对于第一次,以了解机械,和可能功能的复杂性,意义在矩阵架构和生物化学已揭示在最近几年。
该技术测量在GHz频率范围内的机械性能。这一领域从未有过探索生物大分子结构和它既提高了,并提供了手段来回答有关弹性分子机制的根本问题。
我们所描述的步骤,从动物组织中提取的胶原蛋白和弹性纤维,并测量布里渊scatteri纳克光谱使用反射基底达到光纤生物力学的完整描述。在协议中的关键步骤是那些确保纯化的纤维得到和适当的实验条件到位为纤维蛋白的可再现的测量。然而,必须记住,提取程序可以修改的纤维的机械性能承担。
该技术的变型涉及与microfocused布里渊散射和映射光学显微镜的耦合接近13与互补的技术的可能的组合( 例如,拉曼散射)。该技术目前的应用主要集中在离体生物材料,但重要的进展, 例如,那些基于多个VIPA标准具14,都使得有可能从台式到床边这种技术具有广泛的应用已经妖翻译包括体内应用潜力strated 15,16。 VIPA的方法是什么,我们描述的替代;它具有更快的采集时间,但不一定是在不透明的样品的情况下,适当的如这里进行分析。此外,使用在反射性基材的不在于使用VIPA标准具调校实用的,因为它们的对比度将不足以拒绝准弹性光。有关获得的光谱数据集,该材料的固有弱散射截面的速度的限制可能限制应用到动态生物系统,并从内组织深处的采集的数据,但技术精炼可以改善电流的性能。
BLS有望成为生物物理基础研究的细胞外基质的主要工具,从而产生基质生长过程中的新见解的力学性能的演变及其病理损失退化。然而,要记住,测量非侵入,并可能因此在体内进行是重要的。实际上,这已经在角膜16实现,这样的工作可提供新的诊断工具的开发适用范围广的结缔组织病症的平台。
超声弹性和原子力显微镜(AFM)是微机械测量的替代方法,但BLS的技术比前者,不像AFM提供更好的空间分辨率(对亚细胞规模),施加在试样上没有机械力,并且不限制于分析唯一的表面特征。胶原蛋白和弹性模量布里是在GPA的范围,同时从宏观株杨氏模量兆帕的顺序(进一步的细节将另行报道)的。该结果表明与在激励频率的依赖性强的差分弹性模量,由于纤维的粘弹性行为。 BLS可以应用于范围广泛的生物医学科学的问题和材料。它可以在回答有关的生理和生物组织的病理学的问题有所帮助,以及提供的材料和相互作用在分子水平的基本理解的物理工具。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
Euthatal | Merial | J01601A | |
Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
Freezer | Lec | TU55144 | |
Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
Beaker | VWR | 213-0469 | |
Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |