We present a protocol for the application of Brillouin light scattering spectroscopy to elastin and trypsin-purified type I collagen fibers of the extracellular matrix to extract their full elastic properties.
Brillouin spectroscopy is an emerging technique in the biomedical field. It probes the mechanical properties of a sample through the interaction of visible light with thermally induced acoustic waves or phonons propagating at a speed of a few km/sec. Information on the elasticity and structure of the material is obtained in a nondestructive contactless manner, hence opening the way to in vivo applications and potential diagnosis of pathology. This work describes the application of Brillouin spectroscopy to the study of biomechanics in elastin and trypsin-digested type I collagen fibers of the extracellular matrix. Fibrous proteins of the extracellular matrix are the building blocks of biological tissues and investigating their mechanical and physical behavior is key to establishing structure-function relationships in normal tissues and the changes which occur in disease. The procedures of sample preparation followed by measurement of Brillouin spectra using a reflective substrate are presented together with details of the optical system and methods of spectral data analysis.
Brillouin प्रकाश बिखरने (बी एल) के प्रभाव में 1922 1 यह एक सामग्री में सक्रिय thermally ध्वनिक phonons से दृश्य प्रकाश के प्रकीर्णन स्थिर होते Léon Brillouin द्वारा की खोज की थी। ठोस अवस्था भौतिकी में, ध्वनिक phonons एक जाली में सभी परमाणुओं के कंपन सुसंगत हैं। एक जाली में परमाणुओं के दो बारी प्रकार की एक आयामी श्रृंखला ध्वनिक phonons, बीएलएस से पता चला है, और ऑप्टिकल phonons, आईआर अवशोषण और रमन बिखरने (चित्रा 1) द्वारा जांच के बीच के अंतर को दर्शाता हुआ एक सरल मॉडल है। whilst ऑप्टिकल phonons के बाहर के चरण परमाणुओं के आंदोलनों हैं ध्वनिक phonons, प्रसार की दिशा के साथ एक विस्थापन के साथ श्रृंखला में परमाणुओं के चरण में आंदोलन कर रहे हैं (अनुदैर्ध्य ध्वनिक phonons) या प्रसार दिशा (अनुप्रस्थ ध्वनिक phonons) को सीधा (अनुदैर्ध्य या अनुप्रस्थ मोड) एक oscillating बिजली द्विध्रुवीय पल का निर्माण किया।
बीएलएस Spectroscopy 1920 के दशक के बाद से विश्लेषणात्मक विज्ञान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, 1980 के दशक के बाद से ही है उच्च विपरीत माप मिलकर multipass फेब्री पेरोट स्पेक्ट्रोमीटर के उपयोग के माध्यम से संभव हो गया। तब से, एक बढ़ती हुई 2-4 और चुंबकीय सामग्री (फोटोन-Magnon बातचीत के माध्यम से) संघनित पदार्थ (जहां फोटोन-phonon बातचीत शोषण किया जाता है) में विश्लेषणात्मक अनुप्रयोगों के लिए बीएलएस के क्षेत्र में प्रगति की संख्या 5 के बारे में लाया गया है। जैव चिकित्सा अनुप्रयोगों 6-8 पर मौलिक काम करता है विभिन्न तरीकों के विकास के लिए मार्ग प्रशस्त किया है यहाँ लागू एक और पहले से वर्णित 9 एक एक प्लेटलेट की तरह विन्यास में एक चिंतनशील सब्सट्रेट का उपयोग की लोच tensor के पूर्ण विवरण प्राप्त करने के लिए भी शामिल है, एक नमुना।
वर्तमान काम में, हम संयोजी ऊतक में बाह्य मैट्रिक्स के मौलिक घटक, रेशेदार प्रोटीन इलास्टिन के लिए बीएलएस स्पेक्ट्रोस्कोपी लागू करते हैं और प्रकार मैं कोलेजन। टीype मैं कोलेजन एक कठोर, ट्रिपल पेचदार अणु जो laterally और longitudinally व्यापक जोड़ने पार के साथ assembles ऐसे tendons के रूप में ऊतकों में अनिवार्य रूप से कठोर फाइबर के रूप में है। कोलेजन के नेटवर्क अक्सर elastin के नेटवर्क के साथ सह-अस्तित्व में, एक प्रोटीन है, जो असामान्य रूप से, एन्ट्रापी और अपने पर्यावरण के साथ हाइड्रोफोबिक बातचीत का एक संयोजन के माध्यम से लंबी दूरी की लोच उत्पन्न करता है और इस तरह के फेफड़ों और त्वचा के रूप में ऊतकों के कार्य करने के लिए आवश्यक है। दोनों फाइबर वर्तमान अनुसंधान के क्षेत्र में एक हेक्सागोनल क्रिस्टल मॉडल का उपयोग कर मॉडलिंग कर रहे हैं। 9 भाग 1 में, हम प्रोटोकॉल जानवरों के ऊतकों से तंतुओं को निकालने के लिए और स्पेक्ट्रोस्कोपी माप के लिए नमूना तैयार करने का वर्णन है। भाग 2 में, Brillouin तंत्र की स्थापना और फाइबर से स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत किया है। भाग 3 उसमें निहित प्रासंगिक यांत्रिक जानकारी निकालने के लिए Brillouin स्पेक्ट्रा के लिए लागू डेटा विश्लेषण का विवरण देता है। फिर, प्रतिनिधि परिणाम प्रस्तुत किया है और कर रहे हैं discusseघ।
Brillouin बिखरने स्पेक्ट्रोस्कोपी एक अनूठे उपकरण है जिसके द्वारा एक प्रोटीन, फाइबर की लोच tensor के अलग-अलग घटकों अभूतपूर्व विस्तार में विशेषता जा सकता है। इसके अलावा, माप एक सूक्ष्म स्तर पर बनाया जा सकता है और इस तरह जैविक संरचनाओं के सूक्ष्म पैमाने यांत्रिकी में उपन्यास अंतर्दृष्टि के साथ हमें प्रदान करेगा, हमें अनुमति देता है, पहली बार के लिए, यांत्रिक, और शायद कार्यात्मक, जटिलताओं के महत्व को समझने के लिए मैट्रिक्स वास्तुकला और जैव रसायन में हाल के वर्षों में खुलासा किया गया है जो।
तकनीक एक गीगा आवृत्ति रेंज में यांत्रिक गुणों के उपाय। इस डोमेन संरचनात्मक biopolymers के लिए पहले पता लगाया गया कभी नहीं किया है और यह दोनों उठाती है और लोच के आणविक तंत्र के बारे में मौलिक सवालों के जवाब देने के लिए साधन प्रदान करता है।
हम कदम जानवरों के ऊतकों से कोलेजन और elastin तंतुओं को निकालने के लिए और Brillouin scatteri को मापने के लिए वर्णितएनजी स्पेक्ट्रा एक चिंतनशील सब्सट्रेट का उपयोग फाइबर बायोमैकेनिक्स का पूरा विवरण प्राप्त करने के लिए। प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम उन है कि यह सुनिश्चित करें कि शुद्ध फाइबर प्राप्त कर रहे हैं और उचित प्रयोगात्मक शर्तों रेशेदार प्रोटीन की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप के लिए जगह में हैं। हालांकि, यह ध्यान रखें कि निष्कर्षण प्रक्रियाओं फाइबर के यांत्रिक गुणों को संशोधित कर सकते में वहन किया जाना चाहिए।
तकनीक का संशोधन microfocused Brillouin बिखरने और मानचित्रण के लिए ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ युग्मन दृष्टिकोण 13 शामिल है और पूरक तकनीक के साथ संभव संयोजन (जैसे, रमन बिखरने)। तकनीक की वर्तमान अनुप्रयोगों मुख्य रूप से excised जैविक सामग्री पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं, लेकिन महत्वपूर्ण घटनाओं, जैसे, कई Vipa etalons 14 के आधार पर उन लोगों के लिए संभव पहले से ही आवेदन की एक श्रृंखला दानव के साथ बिस्तर को benchtop से इस तकनीक का अनुवाद कर रहे हैंविवो अनुप्रयोगों में संभावित सहित 15,16 strated। Vipa दृष्टिकोण है कि हम क्या वर्णन करने के लिए एक विकल्प है; यह तेजी से अधिग्रहण का समय दिया है, लेकिन जरूरी नहीं कि इस तरह यहां का विश्लेषण किया उन लोगों के रूप अपारदर्शी नमूने के मामले में उचित है। इसके अलावा, एक चिंतनशील सब्सट्रेट के उपयोग की वजह से उनके विपरीत अर्ध लोचदार प्रकाश अस्वीकार करने के लिए पर्याप्त नहीं होगा सेट अप है कि Vipa etalons उपयोग में व्यावहारिक नहीं है। एक वर्णक्रमीय डाटासेट और सामग्री की स्वाभाविक रूप से कमजोर बिखरने क्रॉस सेक्शन के अधिग्रहण की गति से संबंधित सीमाओं गतिशील जैविक प्रणालियों को और गहरी ऊतकों के भीतर से डेटा का अधिग्रहण करने के लिए आवेदन सीमित कर सकता है, लेकिन तकनीकी शोधन मौजूदा प्रदर्शन पर सुधार हो सकता है।
बीएलएस बाह्य मैट्रिक्स पर मौलिक biophysical अनुसंधान के क्षेत्र में एक प्रमुख साधन हो वादा किया है और इस तरह मैट्रिक्स विकास के दौरान यांत्रिक गुणों के विकास में नए अंतर्दृष्टि और रोग में उनके नुकसान का उत्पादन करने के लिएअध: पतन। हालांकि, यह याद है कि माप noninvasive हैं और इसलिए इन विवो में शुरू किया जा सकता है महत्वपूर्ण है। दरअसल, यह पहले से ही कॉर्निया 16 में हासिल किया गया है और इस तरह के काम संयोजी ऊतक विकार की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए नए नैदानिक उपकरण के विकास के लिए एक मंच प्रदान कर सकता है।
अल्ट्रासाउंड elastography और परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM) micromechanical माप के वैकल्पिक तरीके हैं, लेकिन बीएलएस तकनीक पूर्व और AFM के विपरीत, की तुलना में (एक subcellular पैमाने पर) बेहतर स्थानिक संकल्प प्रदान करता है, नमूना पर कोई यांत्रिक बलों लगाता है और करने के लिए ही सीमित नहीं है केवल सतह विशेषताओं का विश्लेषण। कोलेजन और elastin के Brillouin moduli, जीपीए रेंज में हैं whilst स्थूल तनाव से यंग moduli (अधिक जानकारी के लिए कहीं और सूचित किया जाएगा) एमपीए के आदेश के हैं। यह परिणाम उत्तेजना आवृत्ति पर एक मजबूत निर्भरता के साथ एक अंतर लोचदार मापांक इंगित करता है, के कारणफाइबर के viscoelastic व्यवहार। बीएलएस जैव चिकित्सा विज्ञान के क्षेत्र में समस्याओं और सामग्री की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है। यह शरीर विज्ञान और जैविक ऊतकों की विकृति पर सवाल का जवाब देने में मदद कर सकते हैं, साथ ही आणविक स्तर पर सामग्री और बातचीत की बुनियादी समझ के लिए एक भौतिक उपकरण प्रदान करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Engineering and Physical Sciences Research Council [grant number EP/M028739/1]. RSE was supported by a Santander Postgraduate Research Award 2015.
Chondroitinase ABC | Sigma-Aldrich | C2905 | |
Tris Buffer | Fluka | 93358 | |
Sodium Acetate | Fisher Scientific | S608-500 | |
PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | |
Sodium Azide | Fisher Scientific | S2002 | |
Streptomyces Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H1136-1AMP | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S7653 | |
Trypsin | Sigma-Aldrich | T4665 | |
Sodium Phosphate | Sigma-Aldrich | S9638 | |
Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S320-500 | |
Pure Water | Millipore | ZRQS0P3WW | Produced In-House |
Distilled Water | Bibby Scientific Limited | D4000 | Produced In-House from water still |
Euthatal | Merial | J01601A | |
Tandem Interferometer TFP-1 | JRS Scientific Instruments | ||
Freezer | Lec | TU55144 | |
Refrigerator | Zanussi | ZBA15021SA | |
Hot Plate | Fisher Scientific | SP88857206 | |
Clamps | VWR | 241-7311 & 241-7201 | |
Clamp Stand | VWR | 241-0093 | |
Thermometer | Fisher Scientific | 13-201-401 | |
Cling Film | Sainsbury's | 7650540 | |
Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
Silicone | IDB Technologies | N/A | No catalogue number. Order upon request |
Cover Glass | VWR | 631-1571 | |
Conical Flask | VWR | 214-1175 | |
Beaker | VWR | 213-0469 | |
Measuring Cylinder | VWR | 612-3838 | |
Vial | VWR | 548-0051 & 548-0863 | |
Petri Dish | VWR | 391-0441 | |
Scalpel | Swann Morton Ltd | 0914 & 0308 | |
Diamond Scribe | RS Instruments | 394-217 | |
Soldering Iron | RS Instruments | 231-5332 | |
Fine Forceps | VWR | 232-0188 | |
Double Micro-Spatula | VWR | Various Sizes | |
pH Meter | Hanna Instruments | HI-2210-02 | |
Orbital Shaker | IKA | 0002819000 |