Производство и поставка снадобья Применение шелкового наночастицами

Summary

Наночастицы появляются в качестве перспективных систем доставки лекарственных средств для широкого спектра показаний. Здесь мы опишем простой , но мощный способ изготовления наночастиц из шелка с использованием обратной инженерии тутовый шелкопряд шелк. Эти шелковые наночастицы могут быть легко загружены с терапевтическим полезной нагрузки, а затем исследовали для применения доставки лекарств.

Abstract

Шелк является перспективным биополимер для биомедицинских и фармацевтических применений из-за его выдающиеся механические свойства, биосовместимость и биодеградация, а также его способность защищать и впоследствии освободить свою полезную нагрузку в ответ на спусковой крючок. В то время как шелк может быть приготовлена ​​в различных форматах материалов, наночастицы шелка появляются в качестве перспективных систем доставки лекарств. Поэтому в данной статье рассматриваются процедуры обратного инженерного коконов с получением регенерированного шелкового раствора, который можно использовать для создания стабильных наночастиц шелка. Эти наночастицы характеризуются впоследствии, наполненные лекарством, и исследовали в качестве потенциальной системы противоопухолевый доставки лекарственного средства. Вкратце, шелковые коконы обратной инженерии сначала дегуммирования коконов, а затем шелковой растворения и очистки, с получением водного раствора, шелка. Затем регенерированный шелк раствор подвергают nanoprecipitation с получением наночастиц шелка – это простой, но мощный методчто создает однородные наночастицы. Шелковые наночастицы характеризуются в соответствии с их размером, зета-потенциал, морфологии и стабильности в водной среде, а также их способность запутать полезной нагрузки химиотерапевтического и убить клетки рака молочной железы человека. В целом, описанная методика дает однородные наночастицы шелка, которые могут быть легко разведанные для множества приложений, в том числе их использование в качестве потенциального наномедицины.

Introduction

Наноразмерные системы доставки лекарственных средств часто используются для контроля высвобождения лекарственного средства и доставлять разнообразный набор терапевтических полезных нагрузок – например, белки, пептиды и малых препаратов молекулярного веса – в клетки-мишени и ткани. Эти терапевтические полезные нагрузки часто включены в различные макромолекулярных носителей лекарственных средств, таких как липосомы, водорастворимые полимеры ( в том числе и дендримеров), а также микро- и наночастицы ^1. Наночастицы ( которые, как правило , в диапазоне размеров от 1 нм до 1000 нм) , которые в настоящее время широко исследованы в качестве потенциальных носителей лекарственных средств, в частности , для противораковой доставки лекарственных средств ^2. Успешное внедрение Abraxane (120 нм наночастицы размером альбумина на основе загружен с паклитакселом) в повседневную клиническую практику ³ стало катализатором поле, так что многие другие наночастицы для доставки лекарственных средств в настоящее время вступают клинические испытания ^4. Солидные опухоли обычно показывают плохое лимфатический дренаж и имеют протекающие кровеносные сосуды, что означает, что пanoparticles до 200 нм будет пассивно направлены на этих опухолей после внутривенного введения. Это пассивное явление называется нацеливание Улучшенную проницаемость и удерживающую способность (ЭПР) и был впервые описан в 1986 году ^5. ЭПР эффект может привести к 50- до 100-кратного увеличения концентрации препарата в опухоли микроокружения для данной дозы препарата при полезная нагрузка препарат поставляется с использованием макромолекулярную подход носителя лекарственного средства, а не свободное лекарственное средство без носителя. Лекарственное наночастицы загруженным , предназначенные для противораковой доставки лекарственного средства должны достичь микросреды опухоли и часто должны ввести определенный внутриклеточный отделение, как правило , путем эндоцитоза поглощения, для лекарственного средства для достижения ее желаемого терапевтического эффекта ^3. Наночастицы, предназначенные для внутриклеточной доставки лекарственного вещества используют эндоцитоз в качестве шлюза в клетку, а также пути преодоления механизмов лекарственной устойчивости. Высвобождение лекарственного средства из наночастиц часто специально разработан для оCCur в лизосомах (т.е. лизосомотропный доставки лекарственного средства) ⁶ , где рН отзывчивость носителя наночастицами (лизосомальная рН примерно 4,5) может служить триггером для высвобождения лекарственного средства или лизосомальных ферментов, выделяющих полезную нагрузку от носителя ^7.

Много различных классов материалов , могут быть использованы для создания наночастиц (например, металлов и целого ряда органических и неорганических материалов). Тем не менее, биополимеры появляются как привлекательные материалы из – за их известной биосовместимости, биоразлагаемости и низкой токсичностью ^8. Многие биополимеры в настоящее время изучаются, в том числе альбумин, альгинат, хитозан и шелка. Из них, шелк стала перспективным претендентом на развитие в системах доставки лекарственных средств ^9. Шелка различных типов производятся несколькими членистоногих, включая пауков (например, Nephila clavipes) и шелкопрядов (например, тутовый шелкопряд). Шелкопряд шелк используется гораздо больше EXTENключительно, чем шелка паука, потому что шелкопряд полностью одомашнены и, таким образом, его шелк представляет собой воспроизводимое исходный материал. Шелкопряд шелк является Пищевых продуктов и медикаментов (FDA) одобрило материал для использования человеком, в частности, в качестве шовного материала; он имеет надежную показатели безопасности в организме человека и , как известно, разлагаются в естественных условиях ^10. Профиль деградации из шелка может быть доработаны в диапазоне от нескольких часов (низкий кристаллический шелк) до 12 месяцев или более (высокий кристаллический шелк). Шелковые продукты разложения являются нетоксичными и метаболизируются в организме ^10. Шелк структура придает способность связывать небольшие соединения молекулярной массой и макромолекулярных препаратов ¹¹ белка, что делает его хорошим материалом для контролируемого высвобождения лекарственного средства. Белковые препараты (например, антитела) , чувствительны к денатурации, агрегации, протеолитическое расщепление и клиренса иммунной системы. Тем не менее, шелк стабилизирует терапевтические протеины из-за буферной способности его нанокристаллической регионов и его способность адаптировать содержание воды на наноуровне ^11. Эти уникальные особенности обеспечивают физическую защиту и уменьшить полезную нагрузку мобильности ¹¹ и , как правило , не видели с другими (био) полимеров. Многие системы доставки противоракового лекарственного средства, например шелка на основе гидрогелей ^12, пленки ^13-15 и наночастиц ^16,17, в настоящее время разработаны , чтобы использовать эти функции (обзор в ссылках ^18,19)

Здесь наночастицы шелка были охарактеризованы путем определения их размера и заряда в течение длительного периода времени. Доксорубицин, клинически значимый противораковое лекарственное средство, использовали в качестве модельного лекарственного средства для загрузки лекарственного средства и цитотоксичности исследований в тройном отрицательных клеток рака молочной железы человека, обработанных наночастиц шелковых наркотиков загруженным.

Protocol

1. Получение обратной инженерии шелкового решение от тутовый шелкопряд Коконы Примечание: Данная методика основана на протоколах , описанных в других 12,27. Отрежьте 5 г сухих коконов с ножницами на 5 мм х 5 мм штук. Удалите все загрязненные слои. Взвешивают 4,24 г ка?…

Representative Results

Данные были статистически проанализированы , как описано ранее 17. Т-тест Стьюдента используется для пар проб и один дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим многоуровневым сравнением Бонферрони постфактум тест для нескольких образцов. Звездочка обозначает стат…

Discussion

Существуют различные методы для получения наночастиц из шелка, в том числе поливинилового спирта смешивания ^20, распылительная сушка ^21, высаливания ^22, капиллярный MicroDot печати ²³ сверхкритического СО ₂ осадков ²⁴ и nanoprecipitation ^16,25 (обзор в ссылке ^26)….

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system