Fabricação e entrega da droga Aplicações de seda Nanopartículas

Summary

As nanopartículas são emergente sistemas de entrega de drogas como promissores para uma variedade de indicações. Aqui, descrevemos um método simples, mas poderosa para a fabricação de nanopartículas de seda usando engenharia reversa de seda Bombyx mori. Estas nanopartículas de seda pode ser facilmente carregado com uma carga útil terapêutica e subsequentemente exploradas para aplicações de entrega de drogas.

Abstract

A seda é um biopolímero promissora para aplicações biomédicas e farmacêuticas, devido à sua excelentes propriedades mecânicas, biocompatibilidade e biodegradabilidade, bem como a sua capacidade para proteger e, subsequentemente, libertar a sua carga em resposta a um gatilho. Enquanto seda podem ser formulados em vários formatos de materiais, as nanopartículas de seda estão a emergir como sistemas de entrega de drogas promissoras. Portanto, este artigo descreve os procedimentos para casulos de seda engenharia inversa para produzir uma solução de seda regenerada que pode ser usado para gerar nanopartículas de seda estáveis. Estas nanopartículas são posteriormente caracterizado, carregadas com droga e explorado como uma potencial sistema de administração de fármaco anticancerígeno. Resumidamente, casulos de seda são engenharia reversa pela primeira vez por degumming os casulos, seguido por dissolução de seda e limpar, para produzir uma solução aquosa de seda. Em seguida, a solução de seda regenerada é submetido a nanoprecipitação para produzir nanopartículas de seda – Um método simples, mas poderosaque gera nanopartículas uniformes. As nanopartículas de seda são caracterizados de acordo com o seu tamanho, potencial zeta, a morfologia e estabilidade em meio aquoso, bem como a sua capacidade para reter uma carga quimioterapêutico e matar as células do cancro da mama humano. Em geral, a metodologia descrita produz nanopartículas de seda uniformes que possam ser facilmente exploradas por uma miríade de aplicações, incluindo a sua utilização como um potencial nanomedicina.

Introduction

sistemas de distribuição de drogas de tamanho nano são muitas vezes utilizados para controlar a libertação do fármaco e para entregar um conjunto diversificado de cargas úteis terapêuticas – por exemplo, proteínas, peptídeos e drogas pequenas peso molecular – para as células e tecidos alvo. Estas cargas terapêuticos são muitas vezes incorporados em vários veículos de fármacos macromoleculares, tais como lipossomas, polímeros solúveis em água (incluindo dendrímeros), e micro e nanopartículas ^1. Nanopartículas (tipicamente em uma gama de tamanho de 1 nm a 1000 nm) estão a ser amplamente explorados como potenciais portadores de drogas, em particular para drogas anti-cancro de entrega ^2. A introdução bem sucedida de Abraxane (120 nanopartículas à base de albumina porte nm carregado com paclitaxel) em prática clínica rotineira ³ catalisou o campo, de modo que muitos mais nanopartículas para entrega de drogas estão agora a entrar ensaios clínicos ^4. tumores sólidos geralmente mostram a drenagem linfática pobres e têm vasos sanguíneos com vazamentos que significa que nanoparticles de até 200 nm vai ser passivamente voltado para esses tumores, após a administração intravenosa. Este fenómeno é chamado de segmentação passiva a permeabilidade aumentada e retenção de efeito (EPR) e foi relatada pela primeira vez em 1986 ^5. O efeito EPR pode levar a um aumento de 50 a 100 vezes nas concentrações de droga dentro do microambiente do tumor para uma determinada dose de droga quando a carga de fármaco é distribuído através de uma abordagem transportador droga macromolecular, em vez de o fármaco livre, sem o transportador. Nanoparticulas carregadas com fármaco desenhado para entrega de drogas anti-cancro tem que atingir o microambiente do tumor e, muitas vezes tem de inserir um compartimento intracelular específico, geralmente por captação endocítica, para a droga para alcançar o seu efeito terapêutico desejado ^3. Nanopartículas concebidos para a distribuição de droga intracelular explorar endocitose como uma porta de entrada para dentro da célula, bem como uma via para superar os mecanismos de resistência a drogas. A libertação do fármaco a partir das nanopartículas é geralmente concebido especificamente para oCCur nos lisossomos (ou seja, a entrega de drogas lysosomotropic) ^6, onde a capacidade de resposta pH da transportadora de nanopartículas (lisossômico pH aproximadamente 4,5) pode servir como gatilho para enzimas de libertação de droga ou lisossomais que liberam a carga do transportador ^7.

Muitas classes diferentes de materiais podem ser usadas para gerar nanopartículas (por exemplo, metais e muitos materiais orgânicos e inorgânicos). No entanto, os biopolímeros estão surgindo materiais como atraente devido a sua biocompatibilidade conhecida, biodegradabilidade e baixa toxicidade ^8. Muitos biopolímeros estão a ser exploradas, incluindo albumina, alginato, quitosano e seda. Destes, seda tem emergido como uma promissora para o desenvolvimento de sistemas de entrega de medicamentos ^9. As sedas de vários tipos são produzidas por um número de artrópodes, incluindo por exemplo, aranhas (Nephila clavipes) e bicho da seda (Bombyx mori, por exemplo). silk-da-seda é usado muito mais extensivamente de seda de aranha porque o bicho está totalmente domesticada e sua seda representa, assim, um material de partida reprodutível. Silkworm seda é uma Food and Drug Administration (FDA) material aprovado para uso humano, particularmente como material de sutura; que tem um historial de segurança robusta em seres humanos e é conhecido para degradar in vivo ^10. O perfil de degradação da seda podem ser ajustadas para variar de horas (baixo seda cristalina) para 12 meses ou mais (seda de alta cristalina). Produtos de degradação de seda não são tóxicos e são metabolizados no corpo ^10. A estrutura de seda dá a capacidade de se ligar compostos de baixo peso molecular e drogas de proteína macromoleculares ^11, tornando-se um bom material para liberação controlada de drogas. Fármacos de proteína (por exemplo, anticorpos) são susceptíveis à desnaturação, agregação, clivagem proteolítica e a depuração pelo sistema imunológico. No entanto, seda estabiliza proteínas terapêuticas, devido à capacidade tampão do seu nanocristalino reregiões e sua capacidade de adaptar conteúdo de água em nanoescala ^11. Estas características únicas fornecer proteção física e reduzir a mobilidade de carga ¹¹ e, normalmente, não são vistos com outros polímeros (bio). Muitos sistemas de entrega de drogas anticâncer, por exemplo hidrogéis à base de seda ^12, filmes ^13-15 e nanopartículas ^16,17, agora foram desenvolvidos para explorar essas características (revisto em referências ^18,19)

Aqui, as nanopartículas de seda foram caracterizados por determinação do seu tamanho e carga ao longo de um período de tempo prolongado. A doxorubicina, uma droga anti-cancro clinicamente relevante, foi utilizado como uma droga modelo para a carga de fármaco e citotoxicidade estudos em células de cancro da mama humano triplos negativos tratados com nanopartículas de seda carregadas com fármaco.

Protocol

1. Preparação de uma solução de engenharia reversa de seda de Bombyx mori Casulos NOTA: Esta metodologia é baseada em protocolos descritos em outros lugares 12,27. Corte 5 g de casulos secos com uma tesoura em 5 mm x 5 peças mm. Remova todas as camadas sujas. Pesar 4,24 g de carbonato de sódio e adicione cuidadosamente para 2 litros de água fervente destilada. NOTA: Obteve-se uma solução de carbonato de sódio 0,02 M. Adicione os pedaços de cor…

Representative Results

Os dados foram analisados estatisticamente, conforme detalhado anteriormente 17. O teste t de Student foi utilizado para pares de amostras e análise de uma via de variância (ANOVA), seguido de comparações múltiplas de Bonferroni teste post hoc de várias amostras. Um asterisco indica a significância estatística da seguinte forma: * P <0,05 e ** P <0,001. Todos os dados são apresentados como valores médios ± desvio padrão (DP) e os números entre parêntesis in…

Discussion

Estão disponíveis vários métodos para produzir nanopartículas de seda, incluindo álcool polivinílico de mistura ^{20, 21 de} secagem por pulverização, salting out ^22, microdot capilar ^de impressão ^23, _CO2 supercrítico precipitação ²⁴ e nanoprecipitação ^16,25 (revisto em referência ^26). No entanto, nanoprecipitação, devido à sua simplicidade, em geral, é a técnica mais popular para a geração de nanopart?…

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system