Fabbricazione e consegna della droga Applicazioni di seta nanoparticelle

Summary

Le nanoparticelle stanno emergendo sistemi di drug delivery come promettenti per una vasta gamma di indicazioni. Qui, descriviamo un metodo semplice ma potente per la produzione di nanoparticelle di seta con reverse engineering di seta Bombyx mori. Queste nanoparticelle di seta possono essere facilmente caricati con un carico utile terapeutica e successivamente esplorato per le applicazioni di consegna della droga.

Abstract

Seta è un biopolimero promettente per applicazioni biomediche e farmaceutiche per la sua eccellente proprietà meccaniche, biocompatibilità e biodegradabilità, nonché la sua capacità di proteggere e successivamente rilasciare il suo payload in risposta a un trigger. Mentre la seta può essere formulato in vari formati materiali, le nanoparticelle di seta stanno emergendo sistemi di drug delivery come promettenti. Pertanto, questo articolo tratta le procedure per bachi da seta ingegneria inversa per produrre una soluzione di seta rigenerata che può essere utilizzato per generare nanoparticelle seta stabili. Queste nanoparticelle sono successivamente caratterizzati, droga caricata ed esplorato come un potenziale sistema di somministrazione di farmaci anticancro. In breve, bozzoli di seta sono reverse engineering prima dai sgommatura bozzoli, seguita da dissoluzione di seta e pulire, per produrre una soluzione acquosa di seta. Successivamente, la soluzione seta rigenerato viene sottoposto ad nanoprecipitation per produrre nanoparticelle seta – un metodo semplice ma potenteche genera le nanoparticelle uniformi. Le nanoparticelle di seta sono caratterizzati secondo la loro dimensione, potenziale zeta, morfologia e stabilità in mezzi acquosi, come pure la loro capacità di intrappolare un payload chemioterapico e uccidere cellule di carcinoma mammario umano. Nel complesso, la metodologia descritta produce nanoparticelle di seta uniformi che possono essere facilmente esplorato per una miriade di applicazioni, tra cui il loro uso come un potenziale nanomedicina.

Introduction

sistemi di drug delivery di dimensioni nanometriche sono spesso utilizzati per controllare rilascio del farmaco e per fornire un insieme diversificato di payload terapeutici – per esempio, le proteine, peptidi e piccole droghe peso molecolare – per colpire le cellule e tessuti. Questi carichi terapeutiche sono spesso incorporati in vari trasportatori di farmaci macromolecolari, come liposomi, polimeri solubili in acqua (compresi i dendrimeri), e micro- e nanoparticelle ^1. Nanoparticelle (tipicamente in una gamma di dimensioni di 1 nm a 1000 nm) sono ampiamente esplorati come portatori potenziali di droga, in particolare per la somministrazione di farmaci antitumorali ^2. Il successo di Abraxane (120 dimensioni nanoparticelle di albumina nm basata caricati con paclitaxel) nella routine pratica clinica ³ è catalizzata sul campo, in modo che molte più nanoparticelle per la somministrazione di farmaci sono ora entrando studi clinici ^4. Tumori solidi mostrano generalmente scarsa drenaggio linfatico e hanno vasi sanguigni che perde il che significa che nanoparticles fino a 200 nm saranno passivamente mirati a questi tumori in seguito a somministrazione per via endovenosa. Questo fenomeno di targeting passivo è chiamato la permeabilità migliorata e ritenzione effetto (EPR) ed è stata riportata nel 1986 ^5. L'effetto EPR può portare ad un incremento da 50 a 100 volte in concentrazioni del farmaco nel microambiente tumorale per una data dose farmaco quando il payload farmaco viene consegnata usando un approccio carrier macromolecolare farmaco piuttosto che il farmaco libero senza il vettore. Nanoparticelle Drug-caricato progettati per la somministrazione di farmaci antitumorali devono raggiungere il microambiente tumorale e spesso devono entrare in un compartimento intracellulare specifica, di solito per l'assorbimento endocytic, per il farmaco a raggiungere il suo effetto terapeutico desiderato ^3. Nanoparticelle progettati per drug delivery intracellulare sfruttano endocitosi come gateway nella cella e un percorso per superare i meccanismi di resistenza ai farmaci. rilascio del farmaco da nanoparticelle è spesso specificamente progettato per oCCur nei lisosomi (vale a dire, lysosomotropic drug delivery) ⁶ in cui la capacità di risposta del pH del vettore nanoparticelle (lisosomiale pH circa 4,5) può servire come innesco per rilascio controllato di farmaci o lisosomiali enzimi che liberano il payload dal supporto ^7.

Molte diverse classi di materiali possono essere utilizzati per generare nanoparticelle (ad esempio, metalli e molti materiali organici ed inorganici). Tuttavia, biopolimeri stanno emergendo come materiali attraenti a causa della loro biocompatibilità noto, biodegradabilità e bassa tossicità ^8. Molti biopolimeri sono allo studio, tra cui l'albumina, alginato, chitosano e seta. Di questi, la seta è emerso come un concorrente promettente per lo sviluppo in sistemi di drug delivery ^9. Silks di vario tipo sono prodotte da un certo numero di artropodi, tra cui ragni (ad esempio, clavipes Nephila) e bachi da seta (ad esempio, Bombyx mori). la seta del baco da seta è usata molto più extensivamente di seta di ragno, perché il baco da seta è completamente addomesticato e la sua seta rappresenta quindi un materiale di partenza riproducibile. seta baco da seta è un Food and Drug Administration (FDA) ha approvato il materiale per uso umano, in particolare come materiale di sutura; ha un record di sicurezza robusta negli esseri umani ed è noto per degradare in vivo ^10. Il profilo di degradazione della seta può essere messo a punto per variare da ore (basso seta cristallino) a 12 mesi o più (seta di alta cristallino). Seta prodotti di degradazione non sono tossici e sono metabolizzati nel corpo ^10. La struttura di seta conferisce la capacità di legare piccoli composti con peso molecolare e farmaci proteici macromolecolari ^11, che lo rende un buon materiale per il rilascio controllato di farmaci. Farmaci proteici (ad esempio, anticorpi) sono suscettibili di denaturazione, aggregazione, taglio proteolitico e passaggio del sistema immunitario. Tuttavia, la seta si stabilizza proteine ​​terapeutiche a causa della capacità di tamponamento del suo nanocristalli reregioni e la sua capacità di adattare il contenuto d'acqua su scala nanometrica ^11. Queste caratteristiche uniche offrono una protezione fisica e ridurre la mobilità payload ¹¹ e sono in genere non si vedono con altri polimeri (bio). Molti sistemi di somministrazione di farmaci antitumorali, ad esempio idrogel a base di seta ^12, pellicole ^13-15 e nanoparticelle ^16,17, ora sono stati sviluppati per sfruttare queste caratteristiche (rivisto in riferimenti ^18,19)

Qui, le nanoparticelle di seta sono stati caratterizzati da determinare la loro dimensione e la carica su un periodo di tempo prolungato. Doxorubicina, un farmaco antitumorale clinicamente rilevante, è stato utilizzato come modello per gli studi di droga carico di droga e citotossicità in cellule tumorali triple negative seno umano trattati con nanoparticelle di seta droga-caricato.

Protocol

1. Preparazione di una soluzione seta reverse engineering da Bombyx mori Bozzoli NOTA: Questa metodologia si basa su protocolli descritti altrove 12,27. Tagliare 5 g di bozzoli secchi con le forbici in 5 mm x 5 mm pezzi. Rimuovere eventuali strati sporchi. Pesare 4,24 g di carbonato di sodio e aggiungere cautela per 2 L di acqua distillata bollente. NOTA: Questo produce una soluzione di carbonato 0,02 M di sodio. Aggiungere i pezzi Cocoon taglio alla solu…

Representative Results

I dati sono stati analizzati statisticamente come descritto in precedenza 17. t-test di Student è stato utilizzato per coppie di campioni e analisi della varianza ad una via (ANOVA) seguita da confronto multiplo di Bonferroni test post hoc per campioni multipli. Un asterisco indica la significatività statistica come segue: * P <0.05 e ** P <0.001. Tutti i dati sono presentati come valori medi ± deviazione standard (SD) e i numeri tra parentesi indicano il numero di es…

Discussion

Vari metodi sono disponibili per la produzione di nanoparticelle di seta, tra cui alcol polivinilico miscelazione ^20, essiccazione a spruzzo ^21, salatura fuori ^22, microdot capillare stampa ^23, supercritica CO ₂ precipitazioni ²⁴ e nanoprecipitation ^16,25 (rivisto in riferimento ^26). Tuttavia, nanoprecipitation, grazie alla sua semplicità generale, è la tecnica più diffusa per la generazione di nanoparticelle seta. Pertanto, lo sc…

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system