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Articolo metodologico

Fabbricazione e consegna della droga Applicazioni di seta nanoparticelle

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⸱

DOI:

10.3791/54669

⸱

8 ottobre 2016

 ,  , 
1Strathclyde Institute of Pharmacy and Biomedical Sciences, University of Strathclyde

In questo articolo

Sommario

Le nanoparticelle stanno emergendo sistemi di drug delivery come promettenti per una vasta gamma di indicazioni. Qui, descriviamo un metodo semplice ma potente per la produzione di nanoparticelle di seta con reverse engineering di seta Bombyx mori. Queste nanoparticelle di seta possono essere facilmente caricati con un carico utile terapeutica e successivamente esplorato per le applicazioni di consegna della droga.

Abstract

Seta è un biopolimero promettente per applicazioni biomediche e farmaceutiche per la sua eccellente proprietà meccaniche, biocompatibilità e biodegradabilità, nonché la sua capacità di proteggere e successivamente rilasciare il suo payload in risposta a un trigger. Mentre la seta può essere formulato in vari formati materiali, le nanoparticelle di seta stanno emergendo sistemi di drug delivery come promettenti. Pertanto, questo articolo tratta le procedure per bachi da seta ingegneria inversa per produrre una soluzione di seta rigenerata che può essere utilizzato per generare nanoparticelle seta stabili. Queste nanoparticelle sono successivamente caratterizzati, droga caricata ed esplorato come un potenziale sistema di somministrazione di farmaci anticancro. In breve, bozzoli di seta sono reverse engineering prima dai sgommatura bozzoli, seguita da dissoluzione di seta e pulire, per produrre una soluzione acquosa di seta. Successivamente, la soluzione seta rigenerato viene sottoposto ad nanoprecipitation per produrre nanoparticelle seta - un metodo semplice ma potenteche genera le nanoparticelle uniformi. Le nanoparticelle di seta sono caratterizzati secondo la loro dimensione, potenziale zeta, morfologia e stabilità in mezzi acquosi, come pure la loro capacità di intrappolare un payload chemioterapico e uccidere cellule di carcinoma mammario umano. Nel complesso, la metodologia descritta produce nanoparticelle di seta uniformi che possono essere facilmente esplorato per una miriade di applicazioni, tra cui il loro uso come un potenziale nanomedicina.

Introduzione

sistemi di drug delivery di dimensioni nanometriche sono spesso utilizzati per controllare rilascio del farmaco e per fornire un insieme diversificato di payload terapeutici - per esempio, le proteine, peptidi e piccole droghe peso molecolare - per colpire le cellule e tessuti. Questi carichi terapeutiche sono spesso incorporati in vari trasportatori di farmaci macromolecolari, come liposomi, polimeri solubili in acqua (compresi i dendrimeri), e micro- e nanoparticelle 1. Nanoparticelle (tipicamente in una gamma di dimensioni di 1 nm a 1000 nm) sono ampiamente esplorati come portatori potenziali di droga, in particolare per la somministrazione di farmaci antitumorali 2. Il successo di Abraxane (120 dimensioni nanoparticelle di albumina nm basata caricati con paclitaxel) nella routine pratica clinica 3 è catalizzata sul campo, in modo che molte più nanoparticelle per la somministrazione di farmaci sono ora entrando studi clinici 4. Tumori solidi mostrano generalmente scarsa drenaggio linfatico e hanno vasi sanguigni che perde il che significa che nanoparticles fino a 200 nm saranno passivamente mirati a questi tumori in seguito a somministrazione per via endovenosa. Questo fenomeno di targeting passivo è chiamato la permeabilità migliorata e ritenzione effetto (EPR) ed è stata riportata nel 1986 5. L'effetto EPR può portare ad un incremento da 50 a 100 volte in concentrazioni del farmaco nel microambiente tumorale per una data dose farmaco quando il payload farmaco viene consegnata usando un approccio carrier macromolecolare farmaco piuttosto che il farmaco libero senza il vettore. Nanoparticelle Drug-caricato progettati per la somministrazione di farmaci antitumorali devono raggiungere il microambiente tumorale e spesso devono entrare in un compartimento intracellulare specifica, di solito per l'assorbimento endocytic, per il farmaco a raggiungere il suo effetto terapeutico desiderato 3. Nanoparticelle progettati per drug delivery intracellulare sfruttano endocitosi come gateway nella cella e un percorso per superare i meccanismi di resistenza ai farmaci. rilascio del farmaco da nanoparticelle è spesso specificamente progettato per oCCur nei lisosomi (vale a dire, lysosomotropic drug delivery) 6 in cui la capacità di risposta del pH del vettore nanoparticelle (lisosomiale pH circa 4,5) può servire come innesco per rilascio controllato di farmaci o lisosomiali enzimi che liberano il payload dal supporto 7.

Molte diverse classi di materiali possono essere utilizzati per generare nanoparticelle (ad esempio, metalli e molti materiali organici ed inorganici). Tuttavia, biopolimeri stanno emergendo come materiali attraenti a causa della loro biocompatibilità noto, biodegradabilità e bassa tossicità 8. Molti biopolimeri sono allo studio, tra cui l'albumina, alginato, chitosano e seta. Di questi, la seta è emerso come un concorrente promettente per lo sviluppo in sistemi di drug delivery 9. Silks di vario tipo sono prodotte da un certo numero di artropodi, tra cui ragni (ad esempio, clavipes Nephila) e bachi da seta (ad esempio, Bombyx mori). la seta del baco da seta è usata molto più extensivamente di seta di ragno, perché il baco da seta è completamente addomesticato e la sua seta rappresenta quindi un materiale di partenza riproducibile. seta baco da seta è un Food and Drug Administration (FDA) ha approvato il materiale per uso umano, in particolare come materiale di sutura; ha un record di sicurezza robusta negli esseri umani ed è noto per degradare in vivo 10. Il profilo di degradazione della seta può essere messo a punto per variare da ore (basso seta cristallino) a 12 mesi o più (seta di alta cristallino). Seta prodotti di degradazione non sono tossici e sono metabolizzati nel corpo 10. La struttura di seta conferisce la capacità di legare piccoli composti con peso molecolare e farmaci proteici macromolecolari 11, che lo rende un buon materiale per il rilascio controllato di farmaci. Farmaci proteici (ad esempio, anticorpi) sono suscettibili di denaturazione, aggregazione, taglio proteolitico e passaggio del sistema immunitario. Tuttavia, la seta si stabilizza proteine ​​terapeutiche a causa della capacità di tamponamento del suo nanocristalli reregioni e la sua capacità di adattare il contenuto d'acqua su scala nanometrica 11. Queste caratteristiche uniche offrono una protezione fisica e ridurre la mobilità payload 11 e sono in genere non si vedono con altri polimeri (bio). Molti sistemi di somministrazione di farmaci antitumorali, ad esempio idrogel a base di seta 12, pellicole 13-15 e nanoparticelle 16,17, ora sono stati sviluppati per sfruttare queste caratteristiche (rivisto in riferimenti 18,19)

Qui, le nanoparticelle di seta sono stati caratterizzati da determinare la loro dimensione e la carica su un periodo di tempo prolungato. Doxorubicina, un farmaco antitumorale clinicamente rilevante, è stato utilizzato come modello per gli studi di droga carico di droga e citotossicità in cellule tumorali triple negative seno umano trattati con nanoparticelle di seta droga-caricato.

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Protocollo

1. Preparazione di una soluzione seta reverse engineering da Bombyx mori Bozzoli

NOTA: Questa metodologia si basa su protocolli descritti altrove 12,27.

  1. Tagliare 5 g di bozzoli secchi con le forbici in 5 mm x 5 mm pezzi. Rimuovere eventuali strati sporchi.
  2. Pesare 4,24 g di carbonato di sodio e aggiungere cautela per 2 L di acqua distillata bollente.
    NOTA: Questo produce una soluzione di carbonato 0,02 M di sodio.
  3. Aggiungere i pezzi Cocoon taglio alla soluzione di carbonato di sodio bollente e fate bollire per 60 minuti per degum le fibre di seta. Mescolare di tanto in tanto la seta per garantire un trattamento campione omogeneo.
  4. Rimuovere la seta sgommata e lavare con 1 L di acqua distillata per 20 min; ripetere la fase di lavaggio, almeno 3 volte.
  5. Rimuovere la seta lavata e spremere bene per rimuovere il liquido in eccesso e quindi sciogliere / tirare la seta a mano. Posizionare la seta slegato in una cappa aspirante per aria secca durante la notte. Questo produce in genere 3,6 g di s degummedfibre risma.
  6. Il giorno successivo, pesare fibre di seta sgommata essiccati 5 g ed imballare la seta saldamente il fondo di un bicchiere da 50 ml.
  7. Preparare una nuova soluzione 9,3 M bromuro di litio. Sciogliere le fibre di seta in LiBr utilizzando un 1 g di seta al rapporto di 4 ml bromuro di litio. Coprire il campione di seta bromuro di litio con un foglio di alluminio per evitare l'evaporazione e consentire la seta per sciogliere completamente a 60 ° C. Questa fase dura fino a 4 ore ed è aiutata da mescolando di tanto in tanto.
  8. Bagnare una cassetta dialisi (peso molecolare di cut-off di 3.500 Da) in acqua per 5 minuti. Iniettare 15 ml della soluzione di seta LiBr in dialisi cassetto 15 ml e utilizzando un ago e siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria.
  9. Dializzare contro 1 L di acqua distillata e cambiare l'acqua a 1, 3 e 6 ore (cioè, 3 cambi il primo giorno) e di nuovo la mattina successiva e la sera (cioè, 2 cambi il secondo giorno), e di nuovo su la mattina seguente (cioè, 1 cambia il terzo giorno).
  10. Raccogliere i soluti setasul dalla cassetta di dialisi e centrifugare la soluzione per 20 minuti a 5 ° C a 9.500 x g. Recuperare il surnatante e ripetere questo processo di centrifugazione altre due volte.
  11. Determinare il peso di una barca dalla bilancia (W1) e aggiungere 1 ml di soluzione di seta. Registrare il peso di nuovo (W2) e poi asciugare il campione lasciando la barca pesa a 60 ° C durante la notte. Quindi, determinare il peso totale a secco (W3) (seta essiccato e barca pesatura). La concentrazione della soluzione di seta (w / v) è:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.

2. Preparazione di seta nanoparticelle dalla soluzione Silk decodificato

  1. Aggiungere un 5% (w / v) di seta gocce ad acetone mantenendo a> 75% (v / v) di acetone. Ad esempio, aggiungere 9 ml di 5% (w / v) di seta goccia a goccia (10 ul / goccia ad una velocità di 50 gocce / min) a 34 ml di acetone.
  2. Centrifugare precipitato a 48.000 xg per 2 ore a 4 ° C.
  3. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet in acqua distillata dapprima staccare il pellet con una spatola e quindi aggiungendo 20 ml di acqua distillata. Utilizzare puntali per rimuovere il pellet dalla spatola. Dopo vortex per 20 secondi seguita da due cicli di sonicazione usando una sonda ultrasonica al 30% dell'ampiezza per 30 sec, rabboccare il tubo centrifuga per capacità con acqua distillata.
  4. Ripetere la centrifugazione e la risospensione passo almeno due volte.
  5. Risospendere il pellet in 6 ml di acqua distillata, come descritto al punto 2.3 e conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso. Per gli studi di coltura cellulare, le scorte di nanoparticelle di seta possono essere gamma irradiato 17.

3. Determinazione della seta nanoparticelle Concentrazione

  1. nanoparticelle di seta centrifugare a 48.000 xg per 2 ore a 4 ° C.
  2. Raccogliere tutti nanoparticelle in 3 ml di acqua distillata, seguite da due cicli di sonicazione al 30% dell'ampiezza per 30 sec.
  3. Dividere lo stock di nanoparticelle di seta 3 ml in 2 ml e 1 ml sacco e trasferire in pre-pesava 2 ml tubi. Registrare il peso totale del campione 2 ml. Conservare il lotto 1 ml a 4 ° C fino al momento dell'uso; questo campione 1 ml viene utilizzato per generare una curva di calibrazione.
  4. Snap congelare e poi lyophilize il 2 ml di seta di nanoparticelle molto in un liofilizzatore durante la notte. Dopo liofilizzazione, pesare il tubo 2 ml e calcolare la quantità di nanoparticelle seta (mg) che era originariamente presente nel campione 2 ml.
  5. Diluire il 1 ml di seta nanoparticelle magazzino con acqua distillata per generare una curva di calibrazione a 5 punti (0,04-7 mg / ml). Assicurarsi che i campioni non superino la massima assorbanza.
  6. Determinare l'assorbanza di ogni diluizione standard a 600 nm. Questo è fatto meglio con un setup piastra da 96 pozzetti. assorbanza della trama rispetto alla concentrazione (mg / ml) per la curva standard. Quindi utilizzare questa curva standard di routine per determinare la concentrazione di nanoparticelle seta in sospensioni.

4. Preparazione di doxorubicina-caricato Seta nanoparticelle

  1. Preparazione della soluzione doxorubicina
    1. Sciogliere 1,2 mg di doxorubicina cloridrato in 8 ml di acqua distillata.
    2. Portare a 10 ml con acqua distillata per ottenere una azione di lavoro di 116 pg / ml (0,2 mmol / ml).
  2. Preparazione di doxorubicina-caricato Seta nanoparticelle
    1. Mescolare 2 ml di 0,2 mmol / soluzione doxorubicina ml con 200 ml di 10, 30 o 50 mg / ml di nanoparticelle seta in una provetta 2 ml.
    2. Incubare la sospensione seta doxorubicina a temperatura ambiente (25 ° C) per una notte su un agitatore rotante.
    3. Successivamente, centrifugare la sospensione seta doxorubicina a 194.000 xg per 30 min. Lavare le nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato con acqua distillata e ripetere la procedura altre due volte.
    4. PISCINA La surnatante e prendere nota del volume totale (in questo esempio viene utilizzato per determinare l'efficienza di incapsulamento).
    5. Risospendere le nanoparticelle di seta doxorubicina-caricato in acqua distillata, riparo dalla luce e conservare a 4 ° C delle Nazioni Unitetil uso.
  3. Determinazione di incapsulamento Efficienza and Drug Caricamento
    1. Dispensare 200 ml di surnatante dal punto 4.2.4 in un micropiastra nero.
    2. Utilizzare un lettore di micropiastre a fluorescenza per misurare la fluorescenza doxorubicina associata ad una regolazione fotomoltiplicatore fissa.
    3. Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm ed emissione lunghezza d'onda a 590 nm e registrare i valori di fluorescenza.
    4. Genera una curva di calibrazione doxorubicina. Garantire misurazioni vengono acquisiti con le stesse impostazioni dello strumento (ad esempio, con un ambiente fotomoltiplicatore fisso). Usando la curva di calibrazione, calcolare la concentrazione doxorubicina nel surnatante combinato. Ripetere questa misurazione in tre esperimenti indipendenti.
    5. Utilizzare l'equazione (1) per determinare l'efficienza di incapsulamento:
      figure-protocol-1

5. Caratterizzazione di seta Nanoparticelle

  1. La valutazione delle dimensioni e Zeta Potenziale di preparati e memorizzati in seta nanoparticelle.
    1. nanoparticelle Silk Store in acqua distillata a 4 ° C e 25 ° C.
    2. Misurare le dimensioni e potenziale zeta delle nanoparticelle seta nei giorni 0, 14 e 28 utilizzando light scattering dinamico (DLS). Impostare gli indici di rifrazione di 1,33 per l'acqua distillata e 1,60 per le proteine 17. Calcola dimensioni delle particelle con il software di interfaccia utente.
  2. La valutazione morfologica delle nanoparticelle di seta da microscopia elettronica a scansione (SEM).
    1. Posizionare un disco adesivo carbonio su un stub SEM e successivamente collegare un wafer di silicio.
    2. Diluire nanoparticelle seta ad una concentrazione di 1 mg / ml. Pipettare 10 ml di campione su un wafer di silicio, congelare il campione a -80 ° C e lyophilize notte utilizzando un sistema di liofilizzazione secondo le istruzioni del produttore.
    3. Rivestire il campione con un strato di oro fino a uno spessore di 20 nmutilizzando un dispositivo a induzione basso vuoto sputtering.
      NOTA: Le impostazioni dello strumento variano tra i modelli. Il modello utilizzato qui è completamente automatizzato e funziona da solo lo spessore.
    4. campioni di immagine con un microscopio elettronico a scansione a 5 kV ed un ingrandimento di 40.000 volte.

6. In Vitro citotossicità di controllo e di doxorubicina-caricato Seta nanoparticelle

  1. La vitalità cellulare in seguito all'esposizione a nanoparticelle Seta.
    1. Culture MDA-MB-231 cellule in RPMI 1640 con 10% v / v FBS. Cellule piastra su colture di tessuti trattati polistirolo e incubare in un umidificata al 5% di CO 2 nell'atmosfera a 37 ° C. Di routine sottocultura al 80% confluenza ogni 2-3 giorni.
    2. Piatto MDA-MB-231 cellule ad una densità di 2 x 10 4 cellule / cm 2 in piastre da 96 pozzetti. Permettono alle cellule di recuperare durante la notte.
    3. Aggiungere (i) ,001-1 mg doxorubicina liberamente diffusibile, (ii) 0.001-0.5 nanoparticelle di seta mg e 0,1 mg di nanoparticelle di setacaricato con ,001-1 mg doxorubicina in piastre da 96 pozzetti (volume di 100 ml per pozzetto).
    4. Determinare la vitalità cellulare e la metà massima concentrazione inibitoria (IC 50) aggiungendo (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT 5 mg / ml in PBS) a 72 hr. Incubare per 5 ore, svuotare accuratamente i pozzetti con una pipetta e sciogliere il formazano con 100 ml di dimetilsolfossido. Misurare l'assorbanza a 560 nm. Ripetere questa misurazione in tre esperimenti indipendenti.
      NOTA: I valori di assorbanza dei controlli non trattati servono come valore di riferimento per la vitalità cellulare 100%.
  2. SEM di cellule esposte a Silk nanoparticelle.
    1. Seme MDA-MB-231 cellule su vetrini sterili a una densità di 2 x 10 4 cellule / cm 2. Permettono alle cellule di recuperare durante la notte. Esporre le cellule alle condizioni di trattamento desiderate per 72 ore.
    2. Fissare le cellule con 2% v / v glutaraldeide in PBS per 30 minuti, lavare con diacqua calmato due volte, disidratano con una serie di etanolo, e punto critico asciugare i campioni, come descritto altrove 28.
    3. Polverizzazione catodica cappotto i campioni con un oro strato fino a 20 nm di spessore utilizzando un dispositivo a induzione basso vuoto sputtering.
      NOTA: Le impostazioni dello strumento variano tra i modelli. Il modello utilizzato qui è completamente automatizzato e funziona da solo lo spessore.
    4. Immagine campioni di SEM utilizzando una accelerazione degli elettroni di 5 kV e l'ingrandimento di 700 volte.

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Risultati

I dati sono stati analizzati statisticamente come descritto in precedenza 17. t-test di Student è stato utilizzato per coppie di campioni e analisi della varianza ad una via (ANOVA) seguita da confronto multiplo di Bonferroni test post hoc per campioni multipli. Un asterisco indica la significatività statistica come segue: * P <0.05 e ** P <0.001. Tutti i dati sono presentati come valori medi ± deviazione standard (SD) e i numeri tra parentesi indicano il numero di esper...

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Discussione

Vari metodi sono disponibili per la produzione di nanoparticelle di seta, tra cui alcol polivinilico miscelazione 20, essiccazione a spruzzo 21, salatura fuori 22, microdot capillare stampa 23, supercritica CO 2 precipitazioni 24 e nanoprecipitation 16,25 (rivisto in riferimento 26). Tuttavia, nanoprecipitation, grazie alla sua semplicità generale, è la tecnica più diffusa per la generazione di nanoparticelle seta. Pertanto, lo scopo...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione Marie Curie FP7 per l'integrazione professionale 334134 nell'ambito del settimo programma quadro dell'Unione Europea.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
AcetoneVWR International, Radnor, PA, USA20066.33
Essiccatore automatizzato per punti criticiLeica Microsystems, Wetzlar, GermaniaEM CPD300
BilanciamentoMettler Toledo, Greifensee, SvizzeraNewClassic MS
Micropiastra in polistirene nero, 96 pozzettiSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA3991
Capillare cella (DTS 1070)Malvern Instrument, Worcestershire, Regno UnitoDTS107
Disco adesivo in carbonioAgar Scientific, Essex, Regno UnitoCentrifuga G3347N
 Hermle Labortechnik, Wehingen, GermaniaZ323K
 Beckman Coulter, Brea, CA, Stati UnitiAvanti J-E, Rotore: J20
Centrifuga Beckman Coulter, Brea, CA, USAOptima L-70K, Rotore: 50,2 Ti, Adattatore 303392
Coater, basso vuotoLeica Microsystems, Wetzlar, GermaniaEM ACE200
Cuvette, polistirene, monousoFisher Scientific, Waltham, MA, USAFB55147
Doxorubixin LC Laboratories, Boston, MA, USAPipettaggio elettronico D4000
, Easypet Eppendorf, Amburgo, GermaniaN/A
FE-SEMHitachi High-Technologies, Krefeld, GermaniaSU6600
Siero fetale bovinoThermo Scientific, Waltham, MA, USA16000-044
LiofilizzatoreMartin Christ, Osterode, GermaniaEpsilon 2-4
Bozzoli di seta Bombyx mori inattivati a caldoTajima Shoji, Kanagawa, GiapponeN/A
Piastra riscaldante con agitatoreBibby Scientific, Stanffordshire, Regno UnitoUS 152
IncubatoreMemmert, Schwabach, GermaniaINB 200
Insulina, ricombinante umano, soluzione di zincoThermo Scientific, Waltham, MA, USA12585-014
Bromuro di litioAcros Organics, Geel, BelgioAC199870025
MDA-MB-231ATCC, Manassas, VA, U.S.AN/A
Micropipette e puntaliEppendorf, Amburgo, GermaniaN/A
Lettore di micropiastreMolecular devices, Sunnyvale, CA, USASpectraMax M5
Oak Ridge, 50 mlThermo Scientific, Waltham, MA, USAN/A
Provetta in policarbonato a parete spessa open-top, 4 mlBeckman Coulter, Brea, CA, USA
Penicilina/streptomicina Thermo Scientific, Waltham, MA, USA15140-122
RPMI mediumThermo Scientific, Waltham, MA, USA11875-093
Pipette sierologiche, 5 mlSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Wafer di siliconeAgar Scientific, Essex, UKG3391
Cassette per dialisi Slide-A-Lyzer, 3,5K MWCO, 15 mlThermo Scientific, Waltham, MA, USA87724
Carbonato di sodio anidroFisher Scientific, Waltham, MA, USAS/2840/62
Stub di campioni per SEMAgar Scientific, Essex, Regno UnitoG301
Bandelin, Berlino, GermaniaSonoplus HD 2070
Micropiastra trasparente UV, 96 pozzettiSigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA3635
VortexIKA, Staufen, GermaniaGenius 3
ZetasizerMalvern Instrument, Worcestershire, Regno UnitoNano ZS
Zetasizer Software versione 7.11Software DLS
Micro Modulyo  Sistema diliofilizzazione230
Centrifuga Provette per centrifuga ad alta velocità 355645 Omogeneizzatore ad ultrasuoni Thermo Fisher

Riferimenti

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