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Bioengineering

Fabricação e entrega da droga Aplicações de seda Nanopartículas

doi: 10.3791/54669 Published: October 8, 2016

Summary

As nanopartículas são emergente sistemas de entrega de drogas como promissores para uma variedade de indicações. Aqui, descrevemos um método simples, mas poderosa para a fabricação de nanopartículas de seda usando engenharia reversa de seda Bombyx mori. Estas nanopartículas de seda pode ser facilmente carregado com uma carga útil terapêutica e subsequentemente exploradas para aplicações de entrega de drogas.

Abstract

A seda é um biopolímero promissora para aplicações biomédicas e farmacêuticas, devido à sua excelentes propriedades mecânicas, biocompatibilidade e biodegradabilidade, bem como a sua capacidade para proteger e, subsequentemente, libertar a sua carga em resposta a um gatilho. Enquanto seda podem ser formulados em vários formatos de materiais, as nanopartículas de seda estão a emergir como sistemas de entrega de drogas promissoras. Portanto, este artigo descreve os procedimentos para casulos de seda engenharia inversa para produzir uma solução de seda regenerada que pode ser usado para gerar nanopartículas de seda estáveis. Estas nanopartículas são posteriormente caracterizado, carregadas com droga e explorado como uma potencial sistema de administração de fármaco anticancerígeno. Resumidamente, casulos de seda são engenharia reversa pela primeira vez por degumming os casulos, seguido por dissolução de seda e limpar, para produzir uma solução aquosa de seda. Em seguida, a solução de seda regenerada é submetido a nanoprecipitação para produzir nanopartículas de seda - Um método simples, mas poderosaque gera nanopartículas uniformes. As nanopartículas de seda são caracterizados de acordo com o seu tamanho, potencial zeta, a morfologia e estabilidade em meio aquoso, bem como a sua capacidade para reter uma carga quimioterapêutico e matar as células do cancro da mama humano. Em geral, a metodologia descrita produz nanopartículas de seda uniformes que possam ser facilmente exploradas por uma miríade de aplicações, incluindo a sua utilização como um potencial nanomedicina.

Introduction

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sistemas de distribuição de drogas de tamanho nano são muitas vezes utilizados para controlar a libertação do fármaco e para entregar um conjunto diversificado de cargas úteis terapêuticas - por exemplo, proteínas, peptídeos e drogas pequenas peso molecular - para as células e tecidos alvo. Estas cargas terapêuticos são muitas vezes incorporados em vários veículos de fármacos macromoleculares, tais como lipossomas, polímeros solúveis em água (incluindo dendrímeros), e micro e nanopartículas 1. Nanopartículas (tipicamente em uma gama de tamanho de 1 nm a 1000 nm) estão a ser amplamente explorados como potenciais portadores de drogas, em particular para drogas anti-cancro de entrega 2. A introdução bem sucedida de Abraxane (120 nanopartículas à base de albumina porte nm carregado com paclitaxel) em prática clínica rotineira 3 catalisou o campo, de modo que muitos mais nanopartículas para entrega de drogas estão agora a entrar ensaios clínicos 4. tumores sólidos geralmente mostram a drenagem linfática pobres e têm vasos sanguíneos com vazamentos que significa que nanoparticles de até 200 nm vai ser passivamente voltado para esses tumores, após a administração intravenosa. Este fenómeno é chamado de segmentação passiva a permeabilidade aumentada e retenção de efeito (EPR) e foi relatada pela primeira vez em 1986 5. O efeito EPR pode levar a um aumento de 50 a 100 vezes nas concentrações de droga dentro do microambiente do tumor para uma determinada dose de droga quando a carga de fármaco é distribuído através de uma abordagem transportador droga macromolecular, em vez de o fármaco livre, sem o transportador. Nanoparticulas carregadas com fármaco desenhado para entrega de drogas anti-cancro tem que atingir o microambiente do tumor e, muitas vezes tem de inserir um compartimento intracelular específico, geralmente por captação endocítica, para a droga para alcançar o seu efeito terapêutico desejado 3. Nanopartículas concebidos para a distribuição de droga intracelular explorar endocitose como uma porta de entrada para dentro da célula, bem como uma via para superar os mecanismos de resistência a drogas. A libertação do fármaco a partir das nanopartículas é geralmente concebido especificamente para oCCur nos lisossomos (ou seja, a entrega de drogas lysosomotropic) 6, onde a capacidade de resposta pH da transportadora de nanopartículas (lisossômico pH aproximadamente 4,5) pode servir como gatilho para enzimas de libertação de droga ou lisossomais que liberam a carga do transportador 7.

Muitas classes diferentes de materiais podem ser usadas para gerar nanopartículas (por exemplo, metais e muitos materiais orgânicos e inorgânicos). No entanto, os biopolímeros estão surgindo materiais como atraente devido a sua biocompatibilidade conhecida, biodegradabilidade e baixa toxicidade 8. Muitos biopolímeros estão a ser exploradas, incluindo albumina, alginato, quitosano e seda. Destes, seda tem emergido como uma promissora para o desenvolvimento de sistemas de entrega de medicamentos 9. As sedas de vários tipos são produzidas por um número de artrópodes, incluindo por exemplo, aranhas (Nephila clavipes) e bicho da seda (Bombyx mori, por exemplo). silk-da-seda é usado muito mais extensivamente de seda de aranha porque o bicho está totalmente domesticada e sua seda representa, assim, um material de partida reprodutível. Silkworm seda é uma Food and Drug Administration (FDA) material aprovado para uso humano, particularmente como material de sutura; que tem um historial de segurança robusta em seres humanos e é conhecido para degradar in vivo 10. O perfil de degradação da seda podem ser ajustadas para variar de horas (baixo seda cristalina) para 12 meses ou mais (seda de alta cristalina). Produtos de degradação de seda não são tóxicos e são metabolizados no corpo 10. A estrutura de seda dá a capacidade de se ligar compostos de baixo peso molecular e drogas de proteína macromoleculares 11, tornando-se um bom material para liberação controlada de drogas. Fármacos de proteína (por exemplo, anticorpos) são susceptíveis à desnaturação, agregação, clivagem proteolítica e a depuração pelo sistema imunológico. No entanto, seda estabiliza proteínas terapêuticas, devido à capacidade tampão do seu nanocristalino reregiões e sua capacidade de adaptar conteúdo de água em nanoescala 11. Estas características únicas fornecer proteção física e reduzir a mobilidade de carga 11 e, normalmente, não são vistos com outros polímeros (bio). Muitos sistemas de entrega de drogas anticâncer, por exemplo hidrogéis à base de seda 12, filmes 13-15 e nanopartículas 16,17, agora foram desenvolvidos para explorar essas características (revisto em referências 18,19)

Aqui, as nanopartículas de seda foram caracterizados por determinação do seu tamanho e carga ao longo de um período de tempo prolongado. A doxorubicina, uma droga anti-cancro clinicamente relevante, foi utilizado como uma droga modelo para a carga de fármaco e citotoxicidade estudos em células de cancro da mama humano triplos negativos tratados com nanopartículas de seda carregadas com fármaco.

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Protocol

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1. Preparação de uma solução de engenharia reversa de seda de Bombyx mori Casulos

NOTA: Esta metodologia é baseada em protocolos descritos em outros lugares 12,27.

  1. Corte 5 g de casulos secos com uma tesoura em 5 mm x 5 peças mm. Remova todas as camadas sujas.
  2. Pesar 4,24 g de carbonato de sódio e adicione cuidadosamente para 2 litros de água fervente destilada.
    NOTA: Obteve-se uma solução de carbonato de sódio 0,02 M.
  3. Adicione os pedaços de corte casulo para a solução de carbonato de sódio fervente e deixe ferver por 60 minutos para DEGUM as fibras de seda. Agita-se a seda ocasionalmente para assegurar o processamento da amostra homogénea.
  4. Remover a seda desgomif içado e lava-se com 1 L de água destilada durante 20 min; repetir o passo de lavagem, pelo menos, 3 vezes.
  5. Remova a seda lavada e apertá-lo bem para remover o excesso de líquido e depois desatar / puxe a seda à mão. Coloque a seda desatado em um exaustor para o ar seco durante a noite. Isto normalmente produz 3,6 g de s desengomadosfibras laia.
  6. No dia seguinte, pesam-se fibras de seda desgomif içado secas ao ar e 5 g embalar a seda firmemente no fundo de um copo de 50 ml.
  7. Prepare uma nova solução 9,3 M LiBr. Dissolve-se as fibras de seda no LiBr usando um 1 g de seda à relação de 4 mL de LiBr. Cobrir a amostra de LiBr de seda com uma folha de alumínio para evitar a evaporação e permitir que a seda para dissolver completamente a 60 ° C. Esta etapa pode demorar até 4 horas e é auxiliado por mexendo ocasionalmente.
  8. Molhar uma cassete de diálise (peso molecular de corte de 3500 Da) em água, durante 5 min. Injectar 15 mL da solução de LiBr seda na cassete de diálise 15 ml e usar uma agulha e seringa para remover quaisquer bolhas de ar.
  9. Dialisar contra 1 L de água destilada e alterar a água a 1, 3 e 6 h (isto é, 3 mudanças no primeiro dia) e novamente na manhã seguinte, e à noite (isto é, 2 mudanças no segundo dia) e, novamente, em na manhã seguinte (isto é, uma alteração no terceiro dia).
  10. Recolher os soluti sedasobre a partir da cassete de diálise e centrifugar a solução durante 20 min a 5 ° C a 9500 x g. Recuperar o sobrenadante e repetir este processo de centrifugação mais duas vezes.
  11. Determinar o peso de um barco de pesagem vazio (W1) e adicionar 1 ml da solução de seda. Grave o peso novamente (W2) e, em seguida, secar a amostra, deixando o barco pesa a 60 ºC durante a noite. Em seguida, determinar o peso total a seco (W3) (seda seca e pesando barco). A concentração da solução de seda (w / v) é:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.

2. Preparação de seda Nanopartículas de Solução de seda engenharia reversa

  1. Adicionar a 5% (w / v) de solução de seda gota a gota a acetona, mantendo a> 75% (v / v) de solução de acetona. Por exemplo, adicionar 9 ml de um 5% (w / v) gota a gota solução de seda (10 ul / gota a uma taxa de 50 gotas / min) a 34 ml de acetona.
  2. Centrifuga-se o precipitado a 48000 xg durante 2 hr a 4 ° C.
  3. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o Pellet em água destilada pela primeira desalojar o sedimento com uma espátula e em seguida adição de 20 ml de água destilada. Utilizar pontas de pipeta para remover o sedimento a partir da espátula. Após vortex durante 20 seg seguido de dois ciclos de sonicação usando uma sonda de ultra-sons a 30% de amplitude durante 30 seg, topo-se o tubo de centrífuga de capacidade com água destilada.
  4. Repita o passo centrifugação e ressuspensão, pelo menos, duas vezes.
  5. Ressuspender o sedimento em 6 ml de água destilada, tal como descrito em 2.3 e armazenar a 4 ° C até à sua utilização. Para os estudos de cultura de células, os estoques de nanopartículas de seda pode ser irradiadas com raios gama 17.

3. Determinação da Seda nanopartículas Concentração

  1. nanopartículas de seda centrifugar a 48000 xg durante 2 hr a 4 ° C.
  2. Recolhe todas as nanopartículas em 3 ml de água destilada, seguido por dois ciclos de sonicação a 30% de amplitude durante 30 seg.
  3. Divida o stock 3 ml de nanopartículas de seda em 2 ml e 1 ml lotes e transferir para pre-pesava tubos de 2 ml. Registar o peso total da amostra de 2 ml. Armazenar a 1 ml de lote a 4 ° C até à sua utilização; esta amostra 1 mL serão utilizados para gerar uma curva de calibração.
  4. Pressão congelamento e, em seguida, liofilizar o lote 2 ml de nanopartículas de seda num secador por congelação durante a noite. Após liofilização, pesar de novo o tubo de 2 mL e calcular a quantidade de nanopartículas de seda (mg) que estava originalmente presente na amostra de 2 ml.
  5. Diluiu-se a 1 ml de caldo de nanopartículas de seda com água destilada, para gerar uma curva de calibração de 5 pontos (0,04-7 mg / ml). Garantir que as amostras não exceder a máxima absorção.
  6. Determinar a absorvância de cada diluição padrão a 600 nm. Isto é melhor realizado utilizando uma configuração de placa de 96 poços. Lote absorvância em função da concentração (mg / ml) para a curva padrão. Em seguida, use esta curva padrão rotineiramente para determinar a concentração de nanopartículas de seda em suspensões.

4. Preparação de nanopartículas de seda Doxorubicina-carregado

  1. Dissolve-se 1,2 mg de cloridrato de doxorubicina em 8 ml de água destilada.
  2. Completar o volume até 10 ml com água destilada para se obter um estoque de trabalho de 116 ug / ml (0,2 mmol / mL).
  • Preparação de nanopartículas de seda Doxorubicina-carregado
    1. Misturar 2 ml de 0,2 umol / ml de solução de doxorrubicina com 200 ul de 10, 30 ou 50 mg / ml de nanopartículas de seda num tubo de 2 mL.
    2. Incubar a suspensão de seda-doxorrubicina à temperatura ambiente (25 ° C) durante a noite num misturador rotativo.
    3. Em seguida, centrifugar a suspensão de seda-doxorrubicina em 194.000 xg durante 30 min. Lave as nanopartículas de seda carregada com doxorrubicina com água destilada e repetir este procedimento mais duas vezes.
    4. A piscina do sobrenadante e anotar o volume total (este exemplo é usado para determinar a eficiência de encapsulação).
    5. Volte a suspender as nanopartículas de seda carregada com doxorrubicina em água destilada, proteger da luz e armazenar a 4 ºC until uso.
  • Determinação da eficiência de encapsulação e Carga de Droga
    1. Pipete 200 pi do sobrenadante a partir do passo 4.2.4 numa placa negra de microtitulação.
    2. Use um leitor de microplacas de fluorescência para medir a fluorescência associada à doxorrubicina em uma configuração photomultiplier fixa.
    3. Defina o comprimento de onda de excitação a 485 nm de comprimento e emissão a 590 nm e registar os valores de fluorescência.
    4. Gerar uma curva de calibração de doxorrubicina. Medidas garantem são adquiridos com configurações idênticas instrumento (ou seja, com uma configuração photomultiplier fixa). Usando a curva de calibração, calcular a concentração de doxorrubicina no sobrenadante combinados. Repita esta medição em três experimentos independentes.
    5. Use equação (1) para determinar a eficiência de encapsulação:
      equação 1
  • 5. Caracterização de seda Nanopartículas

    1. Avaliação do tamanho e potencial zeta de recém-preparados e armazenados Nanopartículas de seda.
      1. nanopartículas de seda da loja em água destilada a 4 ° C e 25 ° C.
      2. Medir o tamanho e potencial zeta das nanopartículas de seda nos dias 0, 14 e 28 usando dispersão dinâmica de luz (DLS). Definir índices de refração para 1,33 em água destilada e 1,60 para a proteína 17. Calcule tamanhos de partículas com o software de interface do usuário.
    2. Avaliação morfológica de seda Nanopartículas por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV).
      1. Coloque um disco adesivo de carbono sobre um suporte de SEM e depois colocar uma pastilha de silício.
      2. Dilui-se nanopartículas de seda para uma concentração de 1 mg / ml. Pipetar 10 ul da amostra sobre uma bolacha de silício, congelar a amostra a -80 ° C e liofilizar durante a noite utilizando um sistema de secagem por congelação de acordo com as instruções do fabricante.
      3. Brasão da amostra com um ouro camada de até 20 nm de espessurautilizando um revestidor por crepitação baixo vácuo.
        NOTA: As definições do aparelho variam entre os modelos. O modelo utilizado aqui é totalmente automatizado e opera em apenas espessura.
      4. amostras de imagem com um microscópio eletrônico de varredura a 5 kV e uma ampliação de 40.000 vezes.

    6. In Vitro A citotoxicidade de Controle e Doxorrubicina-carregado Nanopartículas Silk

    1. A viabilidade das células após exposição a seda nanopartículas.
      1. Culturas MDA-MB-231 células em RPMI 1640 com 10% v / v de FBS. As células na placa por cultura de tecidos de poliestireno tratada e incubar numa atmosfera humidificada de 5% de CO2 a 37 ° C. Rotineiramente subcultura a 80% de confluência a cada 2-3 dias.
      2. Placa células MDA-MB-231 a uma densidade de 2 x 10 4 células / cm2 em placas de 96 poços. Permitir que as células recuperar durante a noite.
      3. Adicionar (i) 0,001-1 ug doxorrubicina livremente difusivel, (ii) 0,001-0,5 nanopartículas de seda mg e 0,1 mg de seda nanopartículascarregada com doxorrubicina 0,001-1 ug em placas de 96 poços (volume final de 100 ul por poço).
      4. Determinar a viabilidade celular e a metade da concentração máxima inibitória (IC50) através da adição de (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT 5 mg / ml em PBS) a 72 h. Incubar durante 5 h, drenar os poços cuidadosamente com uma pipeta e dissolver o formazano com 100 ul de dimetilsulfóxido. Medir a absorvância a 560 nm. Repetir esta medição em três experiências independentes.
        NOTA: Os valores de absorvância dos controlos não tratados servem como um valor de referência para a viabilidade celular de 100%.
    2. SEM das células expostas a Silk nanopartículas.
      1. Semente MDA-MB-231 células em lamelas de vidro esterilizadas a uma densidade de 2 x 10 4 células / cm2. Permitir que as células recuperar durante a noite. Expor as células para as condições de tratamento desejados durante 72 h.
      2. Fixar as células com 2% v / v em PBS durante 30 min, lava-se com diágua acalmou duas vezes, desidratam com uma série de etanol, e ponto crítico secar as amostras, conforme detalhado em outro lugar 28.
      3. Sputter revestir as amostras com um ouro camada de até 20 nm de espessura utilizando um aplicador de baixo pulverização catódica vácuo.
        NOTA: As definições do aparelho variam entre os modelos. O modelo utilizado aqui é totalmente automatizado e opera em apenas espessura.
      4. Imagem as amostras por SEM usando uma aceleração de elétrons de 5 kV e ampliação de 700 vezes.

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    Representative Results

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    Os dados foram analisados estatisticamente, conforme detalhado anteriormente 17. O teste t de Student foi utilizado para pares de amostras e análise de uma via de variância (ANOVA), seguido de comparações múltiplas de Bonferroni teste post hoc de várias amostras. Um asterisco indica a significância estatística da seguinte forma: * P <0,05 e ** P <0,001. Todos os dados são apresentados como valores médios ± desvio padrão (DP) e os números entre parêntesis indicam o número de experiências independentes.

    Solução de seda regenerada foi preparado e, subsequentemente, adicionado gota a gota a acetona para gerar nanopartículas de seda via nanoprecipitação (Figura 1). Este método produziu uniforme (índice de polidispersidade: 0,1), esférico, as nanopartículas de seda (106,5 ± 1,1 nm) com uma carga de superfície negativa (-49,57 mV ± 0,6) (Figuras 2 e 3). nanopartícula Silk stcapacidade em água foi avaliada por até 28 dias, monitorando tamanho das partículas, potencial zeta e (Figuras 2 e 3) morfologia. Ao longo do período de armazenamento de 28 dias, em cada 4 ° C ou 25 ° C, não houve alteração significativa no tamanho de partícula, de carga (Figura 2) ou morfologia foi observado (Figura 3).

    A doxorubicina foi utilizado como uma droga modelo quimioterapêutico clinicamente relevante para o carregamento da droga e em estudos de citotoxicidade in vitro. Três concentrações diferentes de nanopartículas de seda (10, 30 e 50 mg / ml) foram usadas para avaliar a capacidade de carga de fármaco das nanopartículas de seda. A eficiência doxorrubicina encapsulamento para 10, 30 e 50 mg de nanopartículas de seda / ml (isto é, 2, 6 ou 10 mg de seda e 232 ug de doxorrubicina) era de 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 e 97 ± 0.2%, respectivamente (Figura 4A ). O tamanho de partícula e potencial zeta de doxorrubicina-Lonanopartículas de seda Aded (10 mg) foram medidos e comparados com os controlos de 10 mg de nanopartulas de seda. O tamanho de partícula não se alterou após a carga de fármaco (Figura 4B), enquanto que o potencial Zeta de nanopartículas carregadas com doxorubicina de seda foi significativamente reduzida de 49,57 ± 0,6 mV a 43,52 ± 0,37 mV (Figura 4C).

    A capacidade das nanopartículas de seda carregado com a droga para entregar doxorrubicina e, posteriormente, matar as células cancerosas foi avaliada in vitro. cancro da mama humano células MDA-MB-231 foram expostos a nanopartículas de seda, doxorrubicina livremente difusivel seda ou nanopartículas carregadas com doxorrubicina. A viabilidade das células foi avaliada após um período de exposição de 72 h. Os valores de IC 50 de doxorrubicina livremente difusivel e nanopartículas de seda carregados com doxorrubicina eram de 0,48 ug / ml e 0,24 ug / ml, respectivamente, enquanto que as nanopartículas de seda tinha um IC 50> 5 mg / ml (Figura 5A).Em doses de droga equivalentes de 0,1 ug, a doxorrubicina livremente difusivel e nanopartículas de seda carregados com doxorrubicina resultou em decréscimos significativos na viabilidade celular de 83 ± 11 e 65 ± 11%, respectivamente (Figura 5B). No entanto, a doxorrubicina livremente difusível apresentou maior citotoxicidade substancial do que as nanopartículas de seda carregada com doxorrubicina. Estas medições quantitativas foram corroborados por imagens SEM qualitativa (Figura 5c). Aqui, culturas de controlo mostraram alta densidade celular e um mesenquimal predominando MDA-MB-231 fenótipo; Observações semelhantes foram feitas para culturas expostas a nanopartículas de seda. No entanto, as culturas expostas a doxorrubicina mostrou um fenótipo de células marcadamente diferente. Na dose equivalente de Doxorubicina, MDA-MB-231 tratadas com doxorrubicina livremente difusivel e nanopartículas de seda carregados com doxorrubicina mostraram uma redução substancial no número de células. Além disso, muitas células tinham uma muito ampla e espalhar-se morfologia. culturas exposed de seda nanopartículas carregadas com doxorubicina mostrou evidência de nanopartículas (e seus agregados) associados com a membrana plasmática (Figura 5C).

    figura 1
    Figura 1: Os passos chave para gerar uma solução de seda engenharia reversa e nanopartículas de seda Primeiro, casulos de seda são engenharia inversa por corte e, em seguida, a desgomagem-los durante 60 minutos (isto é, ponto de ebulição), para se obter fibras de seda desengomados.. As fibras são dissolvidos em 9,3 M de LiBr e, em seguida, dialisada contra água durante 72 h. Uma solução aquosa a 5% w / v solução de seda é usado para gerar nanopartículas de seda. A adição gota a gota de seda em acetona conduz à nanoprecipitação seda. Nanopartículas de seda são lavados e recolher para posterior utilização. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

    Figura 2
    Figura 2:. Tamanho e caracterização de carga de nanopartículas de seda de tamanho de partícula e potencial zeta das nanopartículas de seda a 4 ° C e 25 ° C ao longo de 28 dias. ± SD; barras de erro são escondidos dentro do símbolo trama quando não estiver visível, n = 3. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 3
    Figura 3:. A avaliação da qualidade das nanopartículas de seda armazenados a 4 ° C e 25 ° C ao longo de 28 dias nanopartículas de seda foram fotografadas utilizando microscopia electrónica de varrimento (Barra de escala = 1 uM). Please clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 4
    Figura 4: Caracterização das nanopartículas de seda carregados com doxorrubicina (Dox-SNPs) (A) A encapsulação eficiência de 232 ug de doxorrubicina em resposta a diferentes quantidades de nanopartículas de seda (SNPs);. 2, 6 e 10 mg de nanopartículas de seda. A eficiência de encapsulação de 10 mg e nanopartículas de seda 5 mg aumentou significativamente quando comparada com as nanopartículas de seda 2 mg. (B) O tamanho de partícula e (C) potencial Zeta de nanopartículas de seda carregados com doxorrubicina em comparação com o controle nanopartículas de seda (10 mg de nanopartículas de seda). As diferenças estatisticamente significativas para pares de amostras foram determinados com o teste t de Student. várias amostras foram avaliadas por ANOVA one-way, seguido pelo teste de comparação post hoc múltiplas de Bonferroni; * P & #60; 0,05, ** P <0,001, ± SD; barras de erro são escondidos dentro do símbolo trama quando não estiver visível, n = 3. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figura 5
    Figura 5: Citotoxicidade in vitro de nanopartículas de seda e seda nanopartículas carregadas com doxorrubicina em células de cancro da mama humano (A) a viabilidade celular de MDA MB-231, após um ciclo de tratamento de 72 h com nanopartículas de seda (SNPs) (0,01-5 mg. / ml); volumes por poço foram 100 ul. (B) A viabilidade das células de MDA MB-231, após um ciclo de tratamento de 72 h com nanopartículas de seda 0,1 mg, 0,1 mg de doxorrubicina livremente difusivel (Dox) ou 0,1 mg de nanopartículas de seda carregado com 0,1 ug de doxorrubicina (Dox-SNPS). A viabilidade celular foi estatisticamente diminuiu após a exposição a 0,1 ug de doxorrubicina livremente difusivel e 0,1 mg de seda nanopartículas carregadas com 0,1 ug de doxorrubicina, quando comparado com o controlo. Imagens (C) SEM de MDA MB-231 células expostas a (i) meio (controlo), (ii) nanoparticles 0,1 mg de seda, (iii) 0,1 ug de doxorrubicina livremente difusivel, e (iv) nanopartículas de seda carregados com doxorrubicina em doses equivalentes (barra de escala = 50 m). A análise estatística foi realizada por ANOVA one-way, seguido pelo teste hoc comparação pós múltiplas de Bonferroni, ns = não significativo, * P <0,05, ** P <0,001, ± SD; barras de erro são escondidos dentro do símbolo trama quando não estiver visível, n = 3. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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    Discussion

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    Estão disponíveis vários métodos para produzir nanopartículas de seda, incluindo álcool polivinílico de mistura 20, 21 de secagem por pulverização, salting out 22, microdot capilar de impressão 23, CO2 supercrítico precipitação 24 e nanoprecipitação 16,25 (revisto em referência 26). No entanto, nanoprecipitação, devido à sua simplicidade, em geral, é a técnica mais popular para a geração de nanopartículas de seda. Por conseguinte, o objectivo do presente estudo foi aplicar nanoprecipitação de seda engenharia reversa para o fabrico de nanopartículas à base de seda que podem ser usados ​​para uma variedade de aplicações, incluindo a entrega de drogas anti-cancro lysosomotropic.

    Durante a última década, nanoprecipitação tornou-se um dos procedimentos mais comuns para a fabricação de nanopartículas à base de proteínas 29. Nossa 16,17 grupo de pesquisa e outros 25,26,30,31 têm aplicado com sucesso esta tecnologianologia de seda; Aqui, apresentamos um protocolo passo a passo simples, mas robusta para a geração de nanopartículas de seda. Acetona nanoprecipitação origina partículas esféricas de seda que são homogéneas em tamanho e caem normalmente na gama de tamanho de nanómetro. Acetona emergiu como a fase contínua preferida sobre solventes tais como metanol, etanol, isopropanol e butanol 16,25. Acetona produz nanopartículas que têm um reduzido grau de hidratação quando comparado com o metastável de 100-200 nm de tamanho estruturas micelares esféricas presentes nas soluções de seda nativas e regeneradas 32. No entanto, existe a possibilidade de explorar as misturas de solventes e variações no tempo de desagregação da goma, de modo a gerar partículas de (nano) de seda com propriedades potencialmente diferentes aos descritos aqui. O protocolo aqui descrito utiliza a acetona como fase contínua, o que permite o fabrico de partículas uniformes esféricas de tamanho nano-seda (106,5 ± 1,1 nM) que transportam uma carga de superfície negativa (-49,5777; 0,6 mV) e que tem uma embalagem apertada das, correntes de seda cristalina hidrofóbicas 16,17. No geral, o procedimento descrito requer pouco hands-on tempo e produz nanopartículas de seda a partir de uma solução aquosa de seda engenharia reversa (Figura 1). Algumas das principais características deste procedimento incluem o uso de 60 minutos de seda degomado, o tamanho de gota adequado (cerca de 10 mL / gota) e uma taxa máxima de gotejamento de 50 gotas / min. A adesão a estas características chave resulta em um rendimento típico de 14%. Estas nanopartículas são robustos e nós fornecemos evidências de que eles são estáveis ​​e não mudar suas características físicas ao longo de um período de armazenagem de 28 dias. No entanto, uma ressalva potencial do método descrito é a ausência de gerar partículas de mais de uma ampla gama de tamanhos (isto é, a geração de partículas a partir do nanómetro para micrômetro escala mantendo ao mesmo tempo um índice de polidispersão estreita).

    Controlando o tamanho de partícula, cobrar e forma é important para a entrega da droga, particularmente quando alvejando tumores sólidos 33. Partículas na faixa de tamanho de 100 nm estão emergindo como candidatos ideais para o tumor alvo. Portanto, 100 nanopartículas de seda tamanho nm são potenciais candidatos como sistemas de entrega de drogas anticâncer para tratamentos de tumores sólidos. Nanopartículas de seda tem uma carga superficial negativa, o que os torna facilmente carregado com drogas carregados positivamente através da exploração da interação eletrostática 16. No entanto, além de carga, as características de drogas adicionais (por exemplo, logD) são também conhecidos para afectar a carga de droga e libertação 34. No presente estudo, doxorrubicina, um fármaco anti-cancro fracamente básico, foi seleccionado como um modelo droga candidata. O estudo de carga de fármaco (Figura 4) mostrou que o aumento da concentração de nanopartículas de seda levou a um aumento da eficiência de encapsulação de doxorrubicina; 10 mg de nanopartículas de seda pode encapsular 232 ug de doxorrubicina. A carga de droga da seda nanoparticles, por sua vez, resultou em nanopartículas de seda com uma carga de superfície significativamente reduzida, o que era evidência experimental direta confirmando que a interacção de cargas de doxorrubicina-seda é importante para esta combinação de veículo de fármaco em particular.

    Temos anteriormente fornecida evidência de que nanopartículas de seda pode servir como um 16,17 lysosomotropic sistema de administração de fármaco. Aqui, mostramos um teste utilizando nanopartículas de seda carregados com doxorrubicina para tratar a linha de células MDA-MB-231 do cancro da mama humano. Estas células são derivadas de um triplo do cancro da mama negativo altamente invasiva (ER - / PR - / HER2 -) que é difícil de tratar na clínica 35. Portanto, a concepção de um sistema de entrega de drogas sob medida para esta população de pacientes é esperado para produzir enormes benefícios. Na ausência de carga de droga, as nanopartículas de seda não afectou a viabilidade celular (valores de IC50> 5 mg / ml) (Figura 5A, C). No entanto, em equidoses Valent, significativamente maior citotoxicidade foi observada com doxorrubicina livremente difusivel de seda com nanopartículas carregadas com doxorubicina (Figura 5B). As diferenças entre os in vitro farmacocinética celulares de droga ligada livremente difusível e partículas explicar esta observação. A droga livremente difusivel pode rapidamente atravessar a membrana plasmática através de difusão, enquanto que a absorção das nanoparticulas carregadas com droga depende de endocitose. No entanto, a captação endocítica de nanopartículas pode melhorar a retenção da droga e ultrapassar os mecanismos de resistência a drogas 3. No entanto, o verdadeiro benefício da entrega droga anticâncer mediada por nanopartículas é que ele explora o efeito EPR para facilitar a segmentação tumor passivo e para melhorar a farmacocinética. Portanto, a utilização de uma abordagem de entrega de droga à base de nanopartículas só pode ser completamente avaliada in vivo. Estudos in vitro têm limitações (isto é, a ausência do efeito EPR) que impede a charact completoerization destes tipos de sistemas de entrega de medicamento 7.

    Em resumo, a metodologia descrita permite o fabrico fácil das nanopartículas de seda esféricas de tamanho consistente e carga superficial. Estas nanopartículas de seda podem ser utilizadas para uma ampla gama de aplicações (por exemplo, cosméticos, modelos para padronização nano, theranostics, lubrificantes, partículas de controlo para estudos nanotoxicity), incluindo a sua utilização como plataformas de entrega de drogas anti-cancro.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acetone VWR International, Radnor, PA, USA 20066.33
    Automated Critical Point Dryer Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM CPD300
    Balancing Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland NewClassic MS
    Black polystyrene microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3991
    Capillary cell (DTS 1070) Malvern Instrument, Worcestershire, UK DTS107
    Carbon adhesive disc Agar Scientific, Essex, UK G3347N
    Centrifuge  Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany Z323K
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Avanti J-E, Rotor: J20
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
    Coater, low vacuum Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM ACE200
    Cuvettes, polystyrene, disposable Fisher Scientific, Waltham, MA, USA FB55147
    Doxorubixin  LC Laboratories, Boston, MA, USA D4000
    Electronic pipetting, Easypet  Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    FE-SEM Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany SU6600
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 16000-044
    Freeze dryer Martin Christ, Osterode, Germany Epsilon 2-4
    Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons Tajima Shoji, Kanagawa, Japan N/A
    Hotplate with Stirrer Bibby Scientific, Stanffordshire, UK US 152
    Incubator Memmert, Schwabach, Germany INB 200
    Insulin, human recombinant, zinc solution Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 12585-014
    Lithium bromide Acros Organics, Geel, Belgium AC199870025
    MDA-MB-231 ATCC, Manassas, VA, U.S.A N/A
    Micropipette and tips Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    Microplate Reader Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA SpectraMax M5
    Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA N/A
    Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml Beckman Coulter, Brea, CA, USA 355645
    Penicilin/streptomycin  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 15140-122
    RPMI medium Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 11875-093
    Serological pipettes, 5 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
    Silicon wafers Agar Scientific, Essex, UK G3391
    Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 87724
    Sodium carbonate anhydrous Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S/2840/62
    Specimen stubs for SEM Agar Scientific, Essex, UK G301
    Ultrasonic homogenizer Bandelin, Berlin, Germany Sonoplus HD 2070
    UV transparent microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3635
    Vortex IKA, Staufen, Germany Genius 3
    Zetasizer Malvern Instrument, Worcestershire, UK Nano ZS
    Zetasizer Software version 7.11 DLS software
    Micro Modulyo  Thermo Fisher 230 Freeze drying system 

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    References

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    Fabricação e entrega da droga Aplicações de seda Nanopartículas
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    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).More

    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).

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