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Bioengineering

Fabrication and Drug Delivery Applications de soie Nanoparticules

doi: 10.3791/54669 Published: October 8, 2016

Summary

Nanoparticules émergent des systèmes de délivrance de médicaments prometteurs pour un large éventail d'indications. Ici, nous décrivons une méthode simple mais puissant pour la fabrication de nanoparticules de soie en utilisant un reverse engineering soie Bombyx mori. Ces nanoparticules de soie peuvent être facilement chargés avec une charge thérapeutique et ensuite examinées pour des applications de délivrance de médicaments.

Abstract

La soie est un biopolymère prometteur pour des applications biomédicales et pharmaceutiques en raison de son exceptionnelle propriétés mécaniques, la biocompatibilité et la biodégradabilité, ainsi sa capacité à protéger et ensuite libérer sa charge utile en réponse à un déclencheur. Bien que la soie peut être formulé en divers formats matériels, des nanoparticules de soie émergent des systèmes de délivrance de médicaments prometteurs. Par conséquent, cet article porte sur les procédures d'inversion des cocons de soie d'ingénierie pour obtenir une solution de soie régénérée qui peut être utilisé pour générer des nanoparticules de soie stables. Ces nanoparticules sont ensuite caractérisés, chargées de médicament et exploré en tant que système de délivrance de médicament anticancéreux potentiel. En bref, des cocons de soie reverse engineering d'abord par dégommage les cocons, suivie par la dissolution de la soie et le nettoyage, pour donner une solution aqueuse de soie. Ensuite, la solution de soie régénérée est soumis à nanoprécipitation pour obtenir des nanoparticules de soie - une méthode simple mais puissantequi génère des nanoparticules uniformes. Les nanoparticules de soie sont caractérisés en fonction de leur taille, le potentiel zêta, la morphologie et la stabilité dans les milieux aqueux, ainsi que leur capacité à piéger une charge utile chimiothérapeutique et de tuer des cellules de cancer du sein humain. Dans l'ensemble, la méthodologie décrite donne des nanoparticules de soie uniformes qui peuvent être facilement explorées pour une myriade d'applications, y compris leur utilisation comme un nanomédecine potentiel.

Introduction

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les systèmes d'administration de médicaments de taille nanométrique sont souvent utilisés pour contrôler la libération du médicament et de livrer un ensemble diversifié de charges utiles thérapeutiques - par exemple, des protéines, des peptides et des petits médicaments de poids moléculaire - pour cibler les cellules et les tissus. Ces charges thérapeutiques sont souvent incorporés dans divers supports de médicaments macromoléculaires, tels que des liposomes, des polymères solubles dans l'eau (y compris les dendrimères), et micro et nanoparticules 1. Nanoparticules (typiquement dans une plage de taille de 1 nm à 1000 nm) sont largement explorés comme porteurs potentiels de médicaments, en particulier pour les anticancéreux délivrance de médicaments 2. L'introduction réussie d'Abraxane (120 nanoparticules à base d'albumine de taille nm chargés de paclitaxel) dans la pratique clinique de routine 3 a catalysé le terrain, de sorte que beaucoup plus de nanoparticules pour l' administration de médicaments sont maintenant dans des essais cliniques 4. Les tumeurs solides présentent généralement un mauvais drainage lymphatique et ont des vaisseaux sanguins qui fuient ce qui signifie que nanoparticles allant jusqu'à 200 nm, de manière passive seront ciblés sur ces tumeurs après une administration intraveineuse. Ce phénomène de ciblage passif est appelé perméabilité améliorée et une rétention d' effet (EPR) et a été rapportée en 1986 5. L'effet EPR peut conduire à une augmentation de 50 à 100 fois la concentration de drogues dans le microenvironnement tumoral , pour une dose donnée de médicament lorsque la charge utile du médicament est administré en utilisant une approche de véhicule de substance médicamenteuse macromoléculaire, plutôt que le médicament libre sans support. Nanoparticules chargées de médicaments conçus pour la délivrance de médicament anticancéreux doivent atteindre le microenvironnement de la tumeur et doivent souvent entrer dans un compartiment intracellulaire spécifique, généralement par absorption endocytose, pour le médicament pour atteindre son effet thérapeutique souhaité 3. Nanoparticules conçus pour la délivrance intracellulaire du médicament exploitent endocytose comme une passerelle dans la cellule ainsi qu'un itinéraire pour surmonter les mécanismes de résistance aux médicaments. La libération du médicament à partir de nanoparticules est souvent conçu spécifiquement pour oCCur dans les lysosomes ( à savoir, l' administration de médicaments lysosomotrope) 6 où la réactivité du pH du support de nanoparticules (lysosomale pH d' environ 4,5) peut servir de déclencheur pour la libération du médicament ou des enzymes lysosomales qui libèrent de la charge utile du transporteur 7.

De nombreuses classes différentes de matériaux peuvent être utilisés pour produire des nanoparticules (par exemple, des métaux et de nombreux matériaux organiques et inorganiques). Cependant, les biopolymères émergent matériaux attrayants en raison de leur biocompatibilité connue, la biodégradabilité et une faible toxicité 8. Beaucoup de biopolymères sont explorées, y compris l'albumine, l'alginate, le chitosane et la soie. Parmi ceux - ci, de la soie a émergé comme un candidat prometteur pour le développement dans les systèmes de délivrance de médicaments 9. Soies de divers types sont produits par un certain nombre d'arthropodes, y compris les araignées (par exemple, clavipes Nephila) et vers à soie (par exemple, Bombyx mori). soie Silkworm est utilisé beaucoup plus extensivement que la soie d'araignée, car le ver à soie est entièrement domestiqué et sa soie représente donc un matériau de départ reproductible. soie Silkworm est un Food and Drug Administration (FDA) a approuvé un matériau à usage humain, en particulier en tant que matériau de suture; il a un dossier de sécurité robuste chez l' homme et est connu pour dégrader in vivo 10. Le profil de dégradation de la soie peut être affinée entre quelques heures (bas de soie cristalline) à 12 mois ou plus (soie cristalline élevée). Produits de dégradation de la soie sont non-toxiques et sont métabolisés dans le corps 10. La structure de soie donne la capacité de lier des petits composés de poids moléculaire et de médicaments protéiques macromoléculaires 11, ce qui en fait un bon matériau pour la libération contrôlée de médicament. Médicaments protéiques (par exemple des anticorps) sont sensibles à la dénaturation, l' agrégation, le clivage protéolytique et la clairance par le système immunitaire. Cependant, la soie stabilise les protéines thérapeutiques en raison de la capacité de mise en mémoire tampon de son nanocrystalline regions et sa capacité à adapter le contenu de l' eau à l'échelle nanométrique 11. Ces caractéristiques uniques offrent une protection physique et de réduire la mobilité de la charge utile 11 et ne sont généralement pas vus avec d' autres (bio) polymères. De nombreux systèmes d'administration de médicaments anticancéreux, par exemple des hydrogels à base de soie 12, films 13-15 et nanoparticules 16,17, ont maintenant été mis au point pour exploiter ces fonctions (revue dans les références 18,19)

Ici, les nanoparticules de soie ont été caractérisées par la détermination de leur taille et la charge sur une longue période de temps. Doxorubicine, un médicament anti-cancéreux cliniquement pertinente a été utilisé en tant que médicament modèle pour les études de chargement de médicament et la cytotoxicité dans des cellules triple négatif du sein humain cancéreux traités par des nanoparticules de soie chargés en médicament.

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Protocol

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1. Préparation d'une soie Solution de Bombyx mori Cocons de l' ingénierie inverse

NOTE: Cette méthodologie est basée sur les protocoles décrits ailleurs 12,27.

  1. Couper 5 g de cocons secs avec des ciseaux en 5 mm x 5 mm pièces. Retirez toutes les couches souillées.
  2. Peser 4,24 g de carbonate de sodium et on ajoute cette précaution à 2 litres d'eau distillée bouillante.
    Remarque: On obtient ainsi une solution de carbonate de sodium 0,02 M.
  3. Ajouter les morceaux de cocon coupé à la solution de carbonate de sodium bouillante et faire bouillir pendant 60 min à Degum les fibres de soie. Agiter la soie occasionnellement pour assurer le traitement de l'échantillon homogène.
  4. Retirez la soie dégommée et laver avec 1 L d'eau distillée pendant 20 minutes; répéter l'étape de lavage au moins 3 fois.
  5. Retirer la soie lavée et essorez-le bien pour éliminer l'excès de liquide, puis détachez / tirer la soie à la main. Placez la soie déliée dans une hotte à l'air sécher pendant la nuit. Cela donne généralement 3,6 g de s dégomméesfibres acabit.
  6. Le lendemain, peser des fibres de soie dégommée séchés à l'air 5 g et emballer soie étroitement dans le fond d'un bêcher de 50 ml.
  7. Préparer une nouvelle solution 9.3 M LiBr. Dissoudre les fibres de soie en LiBr en utilisant une soie 1 g ratio 4 ml de LiBr. Couvrir l'échantillon de LiBr en soie avec une feuille d'aluminium pour empêcher l'évaporation et laisser la soie se dissoudre complètement à 60 ° C. Cette étape prend jusqu'à 4 h et est facilitée par une agitation de temps en temps.
  8. Mouiller une cassette de dialyse (poids moléculaire de coupure de 3.500 Da) dans l'eau pendant 5 min. Injecter 15 ml de la solution de LiBr de soie dans la cassette de dialyse de 15 ml et utiliser une aiguille et une seringue pour éliminer les bulles d'air.
  9. Dialyser contre 1 L d'eau distillée et changer l'eau à 1, 3 et 6 h (ie, 3 changements sur le premier jour) et de nouveau sur le lendemain matin et le soir ( à savoir, 2 changements sur le deuxième jour), et à nouveau sur le lendemain matin (soit 1 changement le troisième jour).
  10. Ramassez les soluti de soieà partir de la cassette de dialyse et centrifuger la solution pendant 20 min à 5 ° C à 9.500 x g. Récupérer le surnageant et répéter deux fois de plus ce processus de centrifugation.
  11. Déterminer le poids d'un bateau de pesage vide (W1) et ajouter 1 ml de la solution de la soie. Noter le poids à nouveau (W2), puis sécher l'échantillon en laissant le bateau pesant à 60 ºC pendant la nuit. Ensuite, déterminer le poids sec total (W3) (soie séchée et bateau de pesée). La concentration de la solution de la soie (p / v) est la suivante:% = (W3-W1 / W2-W1) x 100.

2. Préparation de la soie Nanoparticules de solution Silk ingénierie inverse

  1. Ajouter 5% (p / v) goutte à goutte une solution de soie à l'acétone tout en maintenant> 75% (v / v) d'acétone. Par exemple, ajouter 9 ml d'une 5% (p / v) de soie goutte à goutte (10 ul / goutte à une vitesse de 50 gouttes / min) à 34 ml d'acétone.
  2. Centrifuger le précipité à 48.000 xg pendant 2 h à 4 ° C.
  3. Aspirer le surnageant et remettre le pellet dans de l'eau distillée par le premier délogeant le culot avec une spatule, puis en ajoutant 20 ml d'eau distillée. Utilisez des conseils pipettes pour enlever le culot de la spatule. Après tourbillonnement pendant 20 secondes, suivi de deux cycles de sonication en utilisant une sonde à ultrasons à 30% d'amplitude pendant 30 secondes, en haut le tube de centrifugation à la capacité avec de l'eau distillée.
  4. Répétez au moins deux fois la centrifugation et l'étape de remise en suspension.
  5. Reprendre le culot dans 6 ml d'eau distillée, comme détaillé dans 2.3 et conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation. Pour les études de culture cellulaire, les stocks de nanoparticules de soie peuvent être gamma irradié 17.

3. Détermination de la Soie Nanoparticules Concentration

  1. Centrifugeuse nanoparticules de soie à 48.000 xg pendant 2 h à 4 ° C.
  2. Collecter toutes les nanoparticules dans 3 ml d'eau distillée, suivi de deux cycles de sonication à 30% d'amplitude pendant 30 secondes.
  3. Divisez le 3 ml Stock de nanoparticules de soie dans 2 ml et 1 ml lots et transférer dans pre-pesé tubes de 2 ml. Enregistrer le poids total de l'échantillon de 2 ml. Stocker le 1 ml lot à 4 ° C jusqu'à utilisation; cet échantillon de 1 ml est utilisé pour générer une courbe d'étalonnage.
  4. gel Snap et puis lyophiliser le 2 ml beaucoup de nanoparticules de soie dans un lyophilisateur du jour au lendemain. Après lyophilisation, soupeser à nouveau le tube de 2 ml et calculer la quantité de nanoparticules de soie (mg) qui était initialement présent dans l'échantillon de 2 ml.
  5. Diluer le 1 ml de nanoparticules de soie disponible avec de l'eau distillée pour générer une courbe d'étalonnage à 5 points (0,04 à 7 mg / ml). Veiller à ce que les échantillons ne dépassent pas le maximum d'absorbance.
  6. Déterminer l'absorbance de chaque dilution standard à 600 nm. Ceci est mieux fait en utilisant une configuration de plaque de 96 puits. Parcelle absorbance en fonction de la concentration (mg / ml) pour la courbe standard. Utilisez ensuite cette courbe standard régulièrement pour déterminer la concentration de nanoparticules de soie dans les suspensions.

4. Préparation de Doxorubicine-chargé Silk Nanoparticules

  1. Dissoudre 1,2 mg de chlorhydrate de doxorubicine dans 8 ml d'eau distillée.
  2. Compléter à 10 ml avec de l'eau distillée pour obtenir un stock de travail de 116 pg / ml (0,2 pmol / ml).
  • Préparation de Doxorubicine-chargé en soie Nanoparticules
    1. Mélanger 2 ml de 0,2 pmol / ml de solution de doxorubicine avec 200 pi de 10, 30 ou 50 mg / ml de nanoparticules de soie dans un tube de 2 ml.
    2. Faire incuber la suspension de soie doxorubicine à la température ambiante (25 ° C) pendant une nuit sur un agitateur rotatif.
    3. Ensuite, centrifuger la suspension de soie-doxorubicine à 194.000 xg pendant 30 min. Laver les nanoparticules de soie doxorubicine chargée avec de l'eau distillée et répéter deux fois cette procédure.
    4. Rassembler le surnageant et notez le volume total (cet échantillon est utilisé pour déterminer l'efficacité d'encapsulation).
    5. Resuspendre les nanoparticules de soie doxorubicine chargée dans l'eau distillée, protéger de la lumière et conserver à 4 ° C nontil utilisation.
  • Détermination de l'efficacité Encapsulation and Drug Loading
    1. Pipet 200 pi du surnageant de l'étape 4.2.4 dans une plaque de microtitrage noire.
    2. Utilisez un lecteur de microplaques à fluorescence pour mesurer la fluorescence de la doxorubicine associée à un réglage de photomultiplicateur fixe.
    3. Réglez la longueur d'onde d'excitation à 485 nm et une longueur d'onde d'émission à 590 nm et enregistrer les valeurs de fluorescence.
    4. Générer une courbe d'étalonnage de la doxorubicine. Assurer des mesures sont acquises avec des réglages identiques aux instruments (c., avec un réglage de photomultiplicateur fixe). En utilisant la courbe d'étalonnage, calculer la concentration de doxorubicine dans le liquide surnageant combiné. Répéter cette mesure dans trois expériences indépendantes.
    5. Utiliser l'équation (1) pour déterminer l'efficacité d'encapsulation:
      L'équation 1
  • 5. Caractérisation de la soie Nanoparticules

    1. Évaluation de la taille et de potentiel Zeta de fraîchement préparés et stockés Silk Nanoparticules.
      1. Magasin nanoparticules de soie dans de l'eau distillée à 4 ° C et 25 ° C.
      2. Mesurer la taille et le potentiel zêta des nanoparticules de soie aux jours 0, 14 et 28 à l'aide de la diffusion de lumière dynamique (DLS). Définir des indices de réfraction de 1,33 pour l' eau distillée et 1,60 pour les protéines 17. Calculer des tailles de particules avec le logiciel d'interface utilisateur.
    2. Évaluation morphologique des nanoparticules en soie par microscopie électronique à balayage (MEB).
      1. Placer un disque adhésif de carbone sur un MEB et ensuite fixer une plaquette de silicium.
      2. Diluer les nanoparticules de soie à une concentration de 1 mg / ml. Introduire à la pipette 10 ul de l'échantillon sur une plaquette de silicium, le gel de l'échantillon à -80 ° C et lyophilisé pendant une nuit en utilisant un système de lyophilisation selon les instructions du fabricant.
      3. Manteau de l'échantillon avec une médaille d'or superposer jusqu'à 20 nm d'épaisseuren utilisant un dispositif d'enduction par pulvérisation cathodique à faible vide.
        REMARQUE: les réglages d'instruments varient selon les modèles. Le modèle utilisé ici est entièrement automatisé et fonctionne en épaisseur seulement.
      4. échantillons d'image avec un microscope électronique à balayage à 5 kV et 40 000 fois le grossissement.

    6. cytotoxicité in vitro de contrôle et de doxorubicine chargé Silk Nanoparticules

    1. Viabilité cellulaire après une exposition à la soie Nanoparticules.
      1. Culture MDA-MB-231 cellules dans du RPMI 1640 avec 10% v / v de FBS. Cellules des plaques sur la culture de tissus traités polystyrène et incuber dans une atmosphère de CO 2 humidifié 5% à 37 ° C. sous-culture routinière à 80% de confluence tous les 2-3 jours.
      2. Plate MDA-MB-231 cellules à une densité de 2 x 10 4 cellules / cm2 dans des plaques à 96 puits. Permettre aux cellules de se rétablir pendant une nuit.
      3. Ajouter: (i) de 0,001 à 1 ug doxorubicine librement diffusible, (ii) 0,001-0,5 mg de nanoparticules de soie et 0,1 mg de nanoparticules de soiechargé avec 0,001-1 pg de doxorubicine dans des plaques à 96 puits (volume final de 100 ul par puits).
      4. Déterminer la viabilité cellulaire et la concentration inhibitrice à demi maximale (IC50) en ajoutant (3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium (MTT à 5 mg / ml dans du PBS) à 72 h. Incuber pendant 5 heures, les égoutter soigneusement les puits avec une pipette et dissoudre le formazan avec 100 ul de diméthylsulfoxyde. mesurer l'absorbance à 560 nm. Répétez cette mesure dans trois expériences indépendantes.
        Remarque: Les valeurs d'absorbance des témoins non traités servent de valeur de référence pour 100% de viabilité cellulaire.
    2. SEM des cellules exposées à la soie Nanoparticules.
      1. Semences MDA-MB-231 cellules sur des lamelles de verre stériles à une densité de 2 x 10 4 cellules / cm 2. Permettre aux cellules de se rétablir pendant une nuit. Exposer les cellules aux conditions de traitement désirées pendant 72 heures.
      2. Fixer les cellules avec 2% v / v de glutaraldéhyde dans du PBS pendant 30 min, laver avec dil' eau deux fois calmé, déshydrater avec une série d'éthanol, et le point critique sécher les échantillons, comme détaillé ailleurs 28.
      3. Pulvérisez cathodiquement les échantillons avec une médaille d'or couche jusqu'à 20 nm d'épaisseur en utilisant une faible coucheuse par pulvérisation cathodique sous vide.
        REMARQUE: les réglages d'instruments varient selon les modèles. Le modèle utilisé ici est entièrement automatisé et fonctionne en épaisseur seulement.
      4. Image des échantillons par SEM en utilisant une accélération d'électrons de 5 kV et 700 fois le grossissement.

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    Representative Results

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    Les données ont été analysées statistiquement comme indiqué précédemment 17. test t de Student a été utilisé pour les paires d'échantillons et l'analyse à sens unique de la variance (ANOVA) suivie par comparaison multiple de Bonferroni de test post hoc pour plusieurs échantillons. Un astérisque indique une signification statistique comme suit: * P <0,05 et ** p <0,001. Toutes les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart-type (SD) et les chiffres entre parenthèses indiquent le nombre d'expériences indépendantes.

    Une solution de soie régénérées a été préparée et ensuite ajoutée goutte à goutte à l' acétone pour produire des nanoparticules de soie par nanoprécipitation (figure 1). Cette méthode a donné uniforme (indice de polydispersité: 0,1), sphérique, des nanoparticules de soie (106,5 nm ± 1,1) avec une charge de surface négative (-49,57 mV ± 0,6) (figures 2 et 3). nanoparticule Soie stla capacité dans l' eau a été évaluée pendant 28 jours en contrôlant la taille des particules, le potentiel zêta et de la morphologie (figures 2 et 3). Au cours de la période de stockage de 28 jours à 4 ° C ou 25 ° C, aucun changement significatif de la taille des particules, la charge (figure 2) ou de la morphologie a été observée (figure 3).

    La doxorubicine a été utilisé en tant que médicament cliniquement pertinente du modèle chimiothérapeutique pour une charge de médicament et dans des études de cytotoxicité in vitro. Trois concentrations de nanoparticules de soie différents (10, 30 et 50 mg / ml) ont été utilisés pour évaluer la capacité de chargement de médicament des nanoparticules de soie. L'efficacité de la doxorubicine d'encapsulation 10, 30 et 50 mg / nanoparticules de soie ml ( par exemple, 2, 6 ou 10 mg de soie et de 232 pg de doxorubicine) était de 73 ± 2,2, 87 ± 1,8 et 97 ± 0,2%, respectivement (figure 4A ). La taille des particules et le potentiel zêta de la doxorubicine-lodes nanoparticules de soie ADED (10 mg) ont été mesurés et comparés à 10 mg de nanoparticules de contrôle de la soie. La taille de particule n'a pas changé après la charge de médicament (figure 4B), tandis que le potentiel zéta des nanoparticules de soie doxorubicine chargée a été significativement réduite de 49,57 ± 0,6 mV à 43,52 ± 0,37 mV (figure 4C).

    La capacité des nanoparticules de soie chargés en médicament à délivrer la doxorubicine et de tuer des cellules cancéreuses par la suite a été évaluée in vitro. cancer du sein humain des cellules MDA-MB-231 ont été exposées à des nanoparticules de soie, doxorubicine librement diffusible ou nanoparticules de soie doxorubicine chargé. La viabilité cellulaire a été évaluée après une période d'exposition de 72 heures. Les valeurs IC50 de la doxorubicine librement diffusible et des nanoparticules de soie doxorubicine ont été chargés 0,48 pg / ml et 0,24 pg / ml, respectivement , alors que les nanoparticules de soie ont une CI50> 5 mg / ml (figure 5A).À des doses de médicament équivalentes de 0,1 ug doxorubicine librement diffusible et des nanoparticules de soie doxorubicine chargées provoqué une diminution significative de la viabilité cellulaire de 83 ± 11 et 65 ± 11%, respectivement (figure 5B). Cependant, la doxorubicine librement diffusible a montré une plus grande cytotoxicité substantielle de nanoparticules de soie doxorubicine chargé. Ces mesures quantitatives ont été corroborées par imagerie SEM qualitative (Figure 5c). Ici, les cultures de contrôle ont montré une densité cellulaire élevée et une mésenchymateuses prédominante MDA-MB-231 phénotype; des observations similaires ont été faites pour les cultures exposées à des nanoparticules de soie. Cependant, les cultures exposées à la doxorubicine a montré un phénotype cellulaire nettement différentes. A la dose de doxorubicine équivalent, MDA-MB-231 cellules traitées avec de la doxorubicine librement diffusible et des nanoparticules de soie doxorubicine chargé a montré une réduction substantielle du nombre de cellules. En outre, de nombreuses cellules avaient une très large et répartis morphologie. cultures expOSED aux nanoparticules de soie doxorubicine chargé a montré des preuves de nanoparticules (et leurs agrégats) associés à la membrane plasmique (figure 5C).

    Figure 1
    Figure 1: Les étapes clés pour générer une solution de soie reverse engineering et des nanoparticules de soie d' abord, cocons de soie reverse engineering en coupant puis dégommage eux pendant 60 min (soit bouillante) pour obtenir des fibres de soie dégommées.. Les fibres sont dissous dans 9,3 M LiBr puis dialysées contre de l'eau pendant 72 heures. Une solution aqueuse à 5% en poids / solution de soie v est utilisée pour générer des nanoparticules de soie. L'addition goutte à goutte de soie dans de l'acétone conduit à nanoprécipitation de soie. Nanoparticules de soie sont lavées et recueillir pour une utilisation ultérieure. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cettefigure.

    Figure 2
    La figure 2. La taille et la caractérisation de la charge des nanoparticules de soie , la taille des particules et le potentiel zêta des nanoparticules de soie à 4 ° C et 25 ° C pendant 28 jours. ± SD; barres d'erreur sont cachés dans le symbole de la parcelle lorsqu'ils ne sont pas visibles, n = 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 3
    Figure 3:. Évaluation de la qualité de nanoparticules de soie stockées à 4 ° C et 25 ° C sur 28 jours nanoparticules de soie ont été imagées par microscopie électronique à balayage (barre d' échelle = 1 um). Please cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 4
    Figure 4: Caractérisation des nanoparticules de soie chargée doxorubicine (Dox-PNS) (A) Encapsulation efficacité de 232 ug doxorubicine en réponse à des quantités différentes de nanoparticules de soie (SNP);. 2, 6 et 10 mg de nanoparticules de soie. L'efficacité d'encapsulation pour 10 mg et 5 mg de nanoparticules de soie a augmenté significativement comparativement à 2 mg de nanoparticules de soie. (B) la taille des particules et (C) de potentiel zéta des nanoparticules de soie doxorubicine chargée par rapport au groupe témoin de nanoparticules de soie (10 mg de nanoparticules de soie). Des différences statistiquement significatives pour les paires d'échantillons ont été déterminées avec le test t de Student. Plusieurs échantillons ont été évalués par ANOVA à une voie, suivie par un test de comparaison post-hoc de Bonferroni multiples; * P & #60; 0,05, ** P <0,001, ± écart-type; barres d'erreur sont cachés dans la parcelle-symbole lorsqu'ils ne sont pas visibles, n = 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

    Figure 5
    Figure 5: cytotoxicité in vitro des nanoparticules de soie et des nanoparticules de soie doxorubicine chargées dans des cellules de cancer du sein humain (A) , la viabilité des cellules de MDA MB-231 après un cycle de traitement de 72 h avec des nanoparticules de soie (PNS) (0,01-5 mg. / ml); volumes par puits étaient 100 pi. (B) La viabilité des cellules de MDA MB-231 après un cycle de traitement de 72 h avec 0,1 mg de nanoparticules de soie, 0,1 pg de doxorubicine librement diffusible (Dox) , soit 0,1 mg de nanoparticules de soie chargé avec 0,1 pg de doxorubicine (Dox-SSNPP). La viabilité cellulaire a été statistiquement diminué à la suite de l'exposition à 0,1 pg de doxorubicine librement diffusible et 0,1 mg de nanoparticules de soie chargées avec 0,1 pg de doxorubicine par rapport au témoin. Images (C) SEM de MDA-MB-231 cellules exposées à (i) milieu (contrôle), (ii) des nanoparticules de 0,1 mg de soie, (iii) 0,1 ug de doxorubicine librement diffusable, et (iv) des nanoparticules de soie doxorubicine chargée à des doses équivalentes (barre d'échelle = 50 pm). L'analyse statistique a été effectuée par une ANOVA suivie par un test de comparaison hoc de poste multiple de Bonferroni, ns = non significatif, * P <0,05, ** P <0,001, ± écart-type; barres d'erreur sont cachés dans la parcelle-symbole lorsqu'ils ne sont pas visibles, n = 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    Discussion

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    Diverses méthodes sont disponibles pour produire des nanoparticules de soie, y compris l' alcool polyvinylique mélange 20, le séchage par atomisation 21, relargage 22, microdot capillaire impression 23, CO 2 supercritique de précipitation 24 et nanoprécipitation 16,25 (examiné en référence 26). Cependant, nanoprécipitation, en raison de sa simplicité globale, est la technique la plus populaire pour générer des nanoparticules de soie. Par conséquent, le but de cette étude était d'appliquer à la soie nanoprécipitation ingénierie inverse pour la fabrication de nanoparticules à base de soie qui peuvent être utilisés pour une gamme d'applications, y compris l'administration de médicaments anticancéreux lysosomotrope.

    Au cours de la dernière décennie, nanoprécipitation est devenue l' une des procédures les plus courantes pour la fabrication de nanoparticules à base de protéines 29. Notre groupe de recherche 16,17 et d' autres 25,26,30,31 ont appliqué avec succès cette technologienologie à la soie; ici, nous présentons un protocole par étapes simple mais robuste pour la génération de nanoparticules de soie. Acétone nanoprécipitation donne des particules de soie sphériques homogènes en taille et se situent typiquement dans la gamme de taille nanométrique. L' acétone est apparue comme la phase continue préférée à des solvants tels que le methanol, l' éthanol, l' isopropanol et le butanol 16,25. L' acétone donne des nanoparticules qui ont un niveau d'hydratation réduit par rapport à la métastable 100 au 200 nm de taille des structures micellaires sphériques présents dans des solutions de soie natives et 32 régénérées. Cependant, il est possible d'explorer les mélanges et les variations dans le temps de dégommage de solvant afin de générer soie (nano) particules ayant des propriétés potentiellement différentes de celles décrites ici. Le protocole décrit ici utilise l'acétone comme phase continue, ce qui permet la fabrication de particules uniformes sphériques de taille nanométrique soie (106,5 ± 1,1 nm) qui portent une charge de surface négative (-49,5777; 0,6 mV) et qui ont un emballage serré des hydrophobes, des chaînes de soie cristalline 16,17. Dans l' ensemble, la procédure décrite nécessite peu de mains sur le temps et les rendements des nanoparticules de soie à partir d' une solution aqueuse de soie ingénierie inverse (Figure 1). Certaines des principales caractéristiques de cette procédure comprennent l'utilisation de 60 minutes de soie dégommée, la taille des gouttes appropriée (environ 10 pl / drop) et un taux de chute maximum de 50 gouttes / min. Le respect de ces caractéristiques clés se traduit par un rendement typique de 14%. Ces nanoparticules sont robustes et nous fournissent la preuve qu'ils sont stables et ne changent pas leurs caractéristiques physiques sur une période de stockage de 28 jours. Toutefois, une mise en garde potentiel de la méthode décrite est l'absence pour générer des particules sur une large gamme de taille (c. -à générer des particules de l'ordre du nanomètre au micromètre échelle tout en maintenant un indice de polydispersité étroit).

    la taille des particules de contrôle, de charger et de la forme est important pour la délivrance de médicaments, en particulier lors du ciblage des tumeurs solides 33. Les particules dans la gamme de taille de 100 nm apparaissent comme des candidats idéaux pour le ciblage tumoral. Par conséquent, 100 nanoparticules de soie de taille nm sont prétendants potentiels comme des systèmes de délivrance de médicaments anticancéreux pour les traitements de tumeurs solides. Nanoparticules de soie ont une charge de surface négative, ce qui les rend facilement chargés avec des médicaments chargés positivement par l' exploitation de l'interaction électrostatique 16. Cependant, en plus de la charge, les caractéristiques des médicaments supplémentaires (par exemple, logd) sont également connus pour affecter la charge de médicament et de libérer 34. Dans la présente étude, la doxorubicine, un médicament anti-cancéreux faiblement basique, a été sélectionné en tant que candidat médicament modèle. L'étude de chargement de médicament (figure 4) montre que l' augmentation de la concentration en nanoparticules de soie a conduit à une plus grande efficacité d'encapsulation de la doxorubicine; 10 mg de nanoparticules de soie peuvent encapsuler 232 ug de doxorubicine. Charge du médicament de la soie nanoparticles, à son tour, conduit à des nanoparticules de soie avec une charge de surface considérablement réduite, ce qui était une preuve expérimentale directe confirmant que l'interaction de charge doxorubicine-soie est important pour cette combinaison particulière de support de médicament.

    Nous avons déjà fourni des preuves que les nanoparticules de soie peuvent servir de système de livraison de médicament 16,17 lysosomotrope. Ici, nous montrons un test utilisant des nanoparticules de soie doxorubicine chargée de traiter la lignée cellulaire MDA-MB-231 du cancer du sein humain. Ces cellules sont dérivées d'un cancer du sein triple négatif très envahissante (ER - / PR - / HER2 -) qui est difficile à traiter dans la clinique 35. Par conséquent, la conception d'un système d'administration de médicaments adaptés à cette population de patients devrait produire des avantages considérables. En l'absence de la charge de médicament, les nanoparticules de soie n'a pas affecté la viabilité cellulaire (valeurs de CI50> 5 mg / ml) (figure 5a, c). Cependant, à equides doses valents, significativement plus élevée a été observée avec la cytotoxicité de la doxorubicine librement diffusible que des nanoparticules de soie doxorubicine chargée (figure 5b). Les différences entre les paramètres pharmacocinétiques cellulaires in vitro de médicament lié librement diffusable et particules expliquent cette observation. Le médicament librement diffusable peut rapidement traverser la membrane plasmique par diffusion, alors que l'absorption des nanoparticules chargées de médicaments repose sur l'endocytose. Néanmoins, l' absorption endocytique de nanoparticules peut améliorer la rétention du médicament et de surmonter les mécanismes de résistance aux médicaments 3. Cependant, le véritable avantage de livraison médicament anticancéreux nanoparticule médiation est qu'elle exploite l'effet EPR pour faciliter le ciblage de la tumeur passive et d'améliorer la pharmacocinétique. Par conséquent, l'utilisation d'une approche de délivrance de médicaments à base de nanoparticules ne peut être pleinement évaluée in vivo. Des études in vitro ont des limites ( par exemple, l'absence de l'effet EPR) qui empêche la pleine characterization de ces types de systèmes de délivrance de médicaments à 7.

    En résumé, la méthodologie décrite permet la fabrication facile de nanoparticules de soie sphériques de taille uniforme et la charge de surface. Ces nanoparticules de soie peuvent être utilisés pour une large gamme d'applications (par exemple, des cosmétiques, des modèles pour les nano patterning, théranostic, lubrifiants, des particules de contrôle pour les études de nanotoxicité), y compris leur utilisation comme plates - formes de distribution de médicaments anticancéreux.

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    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Acetone VWR International, Radnor, PA, USA 20066.33
    Automated Critical Point Dryer Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM CPD300
    Balancing Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland NewClassic MS
    Black polystyrene microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3991
    Capillary cell (DTS 1070) Malvern Instrument, Worcestershire, UK DTS107
    Carbon adhesive disc Agar Scientific, Essex, UK G3347N
    Centrifuge  Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany Z323K
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Avanti J-E, Rotor: J20
    Centrifuge  Beckman Coulter, Brea, CA, USA Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
    Coater, low vacuum Leica Microsystems, Wetzlar, Germany EM ACE200
    Cuvettes, polystyrene, disposable Fisher Scientific, Waltham, MA, USA FB55147
    Doxorubixin  LC Laboratories, Boston, MA, USA D4000
    Electronic pipetting, Easypet  Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    FE-SEM Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany SU6600
    Fetal Bovine Serum Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 16000-044
    Freeze dryer Martin Christ, Osterode, Germany Epsilon 2-4
    Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons Tajima Shoji, Kanagawa, Japan N/A
    Hotplate with Stirrer Bibby Scientific, Stanffordshire, UK US 152
    Incubator Memmert, Schwabach, Germany INB 200
    Insulin, human recombinant, zinc solution Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 12585-014
    Lithium bromide Acros Organics, Geel, Belgium AC199870025
    MDA-MB-231 ATCC, Manassas, VA, U.S.A N/A
    Micropipette and tips Eppendorf, Hamburg, Germany N/A
    Microplate Reader Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA SpectraMax M5
    Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA N/A
    Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml Beckman Coulter, Brea, CA, USA 355645
    Penicilin/streptomycin  Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 15140-122
    RPMI medium Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 11875-093
    Serological pipettes, 5 ml Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
    Silicon wafers Agar Scientific, Essex, UK G3391
    Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 87724
    Sodium carbonate anhydrous Fisher Scientific, Waltham, MA, USA S/2840/62
    Specimen stubs for SEM Agar Scientific, Essex, UK G301
    Ultrasonic homogenizer Bandelin, Berlin, Germany Sonoplus HD 2070
    UV transparent microplate, 96 well Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 3635
    Vortex IKA, Staufen, Germany Genius 3
    Zetasizer Malvern Instrument, Worcestershire, UK Nano ZS
    Zetasizer Software version 7.11 DLS software
    Micro Modulyo  Thermo Fisher 230 Freeze drying system 

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    References

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    Fabrication and Drug Delivery Applications de soie Nanoparticules
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    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).More

    Wongpinyochit, T., Johnston, B. F., Seib, F. P. Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles. J. Vis. Exp. (116), e54669, doi:10.3791/54669 (2016).

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