Fabrication and Drug Delivery Applications de soie Nanoparticules

Summary

Nanoparticules émergent des systèmes de délivrance de médicaments prometteurs pour un large éventail d'indications. Ici, nous décrivons une méthode simple mais puissant pour la fabrication de nanoparticules de soie en utilisant un reverse engineering soie Bombyx mori. Ces nanoparticules de soie peuvent être facilement chargés avec une charge thérapeutique et ensuite examinées pour des applications de délivrance de médicaments.

Abstract

La soie est un biopolymère prometteur pour des applications biomédicales et pharmaceutiques en raison de son exceptionnelle propriétés mécaniques, la biocompatibilité et la biodégradabilité, ainsi sa capacité à protéger et ensuite libérer sa charge utile en réponse à un déclencheur. Bien que la soie peut être formulé en divers formats matériels, des nanoparticules de soie émergent des systèmes de délivrance de médicaments prometteurs. Par conséquent, cet article porte sur les procédures d'inversion des cocons de soie d'ingénierie pour obtenir une solution de soie régénérée qui peut être utilisé pour générer des nanoparticules de soie stables. Ces nanoparticules sont ensuite caractérisés, chargées de médicament et exploré en tant que système de délivrance de médicament anticancéreux potentiel. En bref, des cocons de soie reverse engineering d'abord par dégommage les cocons, suivie par la dissolution de la soie et le nettoyage, pour donner une solution aqueuse de soie. Ensuite, la solution de soie régénérée est soumis à nanoprécipitation pour obtenir des nanoparticules de soie – une méthode simple mais puissantequi génère des nanoparticules uniformes. Les nanoparticules de soie sont caractérisés en fonction de leur taille, le potentiel zêta, la morphologie et la stabilité dans les milieux aqueux, ainsi que leur capacité à piéger une charge utile chimiothérapeutique et de tuer des cellules de cancer du sein humain. Dans l'ensemble, la méthodologie décrite donne des nanoparticules de soie uniformes qui peuvent être facilement explorées pour une myriade d'applications, y compris leur utilisation comme un nanomédecine potentiel.

Introduction

les systèmes d'administration de médicaments de taille nanométrique sont souvent utilisés pour contrôler la libération du médicament et de livrer un ensemble diversifié de charges utiles thérapeutiques – par exemple, des protéines, des peptides et des petits médicaments de poids moléculaire – pour cibler les cellules et les tissus. Ces charges thérapeutiques sont souvent incorporés dans divers supports de médicaments macromoléculaires, tels que des liposomes, des polymères solubles dans l'eau (y compris les dendrimères), et micro et nanoparticules ^1. Nanoparticules (typiquement dans une plage de taille de 1 nm à 1000 nm) sont largement explorés comme porteurs potentiels de médicaments, en particulier pour les anticancéreux délivrance de médicaments ^2. L'introduction réussie d'Abraxane (120 nanoparticules à base d'albumine de taille nm chargés de paclitaxel) dans la pratique clinique de routine ³ a catalysé le terrain, de sorte que beaucoup plus de nanoparticules pour l' administration de médicaments sont maintenant dans des essais cliniques ^4. Les tumeurs solides présentent généralement un mauvais drainage lymphatique et ont des vaisseaux sanguins qui fuient ce qui signifie que nanoparticles allant jusqu'à 200 nm, de manière passive seront ciblés sur ces tumeurs après une administration intraveineuse. Ce phénomène de ciblage passif est appelé perméabilité améliorée et une rétention d' effet (EPR) et a été rapportée en 1986 ^5. L'effet EPR peut conduire à une augmentation de 50 à 100 fois la concentration de drogues dans le microenvironnement tumoral , pour une dose donnée de médicament lorsque la charge utile du médicament est administré en utilisant une approche de véhicule de substance médicamenteuse macromoléculaire, plutôt que le médicament libre sans support. Nanoparticules chargées de médicaments conçus pour la délivrance de médicament anticancéreux doivent atteindre le microenvironnement de la tumeur et doivent souvent entrer dans un compartiment intracellulaire spécifique, généralement par absorption endocytose, pour le médicament pour atteindre son effet thérapeutique souhaité ^3. Nanoparticules conçus pour la délivrance intracellulaire du médicament exploitent endocytose comme une passerelle dans la cellule ainsi qu'un itinéraire pour surmonter les mécanismes de résistance aux médicaments. La libération du médicament à partir de nanoparticules est souvent conçu spécifiquement pour oCCur dans les lysosomes ( à savoir, l' administration de médicaments lysosomotrope) ⁶ où la réactivité du pH du support de nanoparticules (lysosomale pH d' environ 4,5) peut servir de déclencheur pour la libération du médicament ou des enzymes lysosomales qui libèrent de la charge utile du transporteur ^7.

De nombreuses classes différentes de matériaux peuvent être utilisés pour produire des nanoparticules (par exemple, des métaux et de nombreux matériaux organiques et inorganiques). Cependant, les biopolymères émergent matériaux attrayants en raison de leur biocompatibilité connue, la biodégradabilité et une faible toxicité ^8. Beaucoup de biopolymères sont explorées, y compris l'albumine, l'alginate, le chitosane et la soie. Parmi ceux – ci, de la soie a émergé comme un candidat prometteur pour le développement dans les systèmes de délivrance de médicaments ^9. Soies de divers types sont produits par un certain nombre d'arthropodes, y compris les araignées (par exemple, clavipes Nephila) et vers à soie (par exemple, Bombyx mori). soie Silkworm est utilisé beaucoup plus extensivement que la soie d'araignée, car le ver à soie est entièrement domestiqué et sa soie représente donc un matériau de départ reproductible. soie Silkworm est un Food and Drug Administration (FDA) a approuvé un matériau à usage humain, en particulier en tant que matériau de suture; il a un dossier de sécurité robuste chez l' homme et est connu pour dégrader in vivo ^10. Le profil de dégradation de la soie peut être affinée entre quelques heures (bas de soie cristalline) à 12 mois ou plus (soie cristalline élevée). Produits de dégradation de la soie sont non-toxiques et sont métabolisés dans le corps ^10. La structure de soie donne la capacité de lier des petits composés de poids moléculaire et de médicaments protéiques macromoléculaires ^11, ce qui en fait un bon matériau pour la libération contrôlée de médicament. Médicaments protéiques (par exemple des anticorps) sont sensibles à la dénaturation, l' agrégation, le clivage protéolytique et la clairance par le système immunitaire. Cependant, la soie stabilise les protéines thérapeutiques en raison de la capacité de mise en mémoire tampon de son nanocrystalline regions et sa capacité à adapter le contenu de l' eau à l'échelle nanométrique ^11. Ces caractéristiques uniques offrent une protection physique et de réduire la mobilité de la charge utile ¹¹ et ne sont généralement pas vus avec d' autres (bio) polymères. De nombreux systèmes d'administration de médicaments anticancéreux, par exemple des hydrogels à base de soie ^12, films ^13-15 et nanoparticules ^16,17, ont maintenant été mis au point pour exploiter ces fonctions (revue dans les références ^18,19)

Ici, les nanoparticules de soie ont été caractérisées par la détermination de leur taille et la charge sur une longue période de temps. Doxorubicine, un médicament anti-cancéreux cliniquement pertinente a été utilisé en tant que médicament modèle pour les études de chargement de médicament et la cytotoxicité dans des cellules triple négatif du sein humain cancéreux traités par des nanoparticules de soie chargés en médicament.

Protocol

1. Préparation d'une soie Solution de Bombyx mori Cocons de l' ingénierie inverse NOTE: Cette méthodologie est basée sur les protocoles décrits ailleurs 12,27. Couper 5 g de cocons secs avec des ciseaux en 5 mm x 5 mm pièces. Retirez toutes les couches souillées. Peser 4,24 g de carbonate de sodium et on ajoute cette précaution à 2 litres d'eau distillée bouillante. Remarque: On obtient ainsi une solution de carbonate de sodium 0,02 M. <l…

Representative Results

Les données ont été analysées statistiquement comme indiqué précédemment 17. test t de Student a été utilisé pour les paires d'échantillons et l'analyse à sens unique de la variance (ANOVA) suivie par comparaison multiple de Bonferroni de test post hoc pour plusieurs échantillons. Un astérisque indique une signification statistique comme suit: * P <0,05 et ** p <0,001. Toutes les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes ± écart-ty…

Discussion

Diverses méthodes sont disponibles pour produire des nanoparticules de soie, y compris l' alcool polyvinylique mélange ^20, le séchage par atomisation ^21, relargage ^22, microdot capillaire impression ^23, CO ₂ supercritique de précipitation ²⁴ et nanoprécipitation ^16,25 (examiné en référence ^26). Cependant, nanoprécipitation, en raison de sa simplicité globale, est la technique la plus populaire pour générer des nanopar…

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system