Herstellung und Drug-Delivery-Anwendungen von Silk Nanopartikel

Summary

Nanopartikel sind, sich als viel versprechende Wirkstoffabgabesysteme für ein breites Spektrum von Indikationen. Hier beschreiben wir eine einfache , aber leistungsfähige Methode Seide Nanopartikel mit Reverse Engineering Bombyx mori Seide herzustellen. Diese Seide Nanopartikel können leicht mit einem therapeutischen Nutzlast beladen werden und anschließend für Drug-Delivery-Anwendungen untersucht.

Abstract

Seide ist ein vielversprechender Biopolymer für biomedizinische und pharmazeutische Anwendungen aufgrund ihrer hervorragenden mechanischen Eigenschaften, Biokompatibilität und biologische Abbaubarkeit sowie ihre Fähigkeit zu schützen und anschließend freizugeben seine Nutzlast in Antwort auf ein Trigger. Während Seide kann in verschiedenen Materialformaten formuliert werden, Seide Nanopartikel sind, sich als viel versprechende Wirkstoffabgabesysteme. Daher deckt dieser Artikel die Verfahren für Reverse-Engineering-Seidenkokons eine regenerierte Seiden Lösung zu erhalten, die verwendet werden können, stabile Seide Nanopartikel zu erzeugen. Diese Nanopartikel werden anschließend charakterisiert, Wirkstoff beladen und als potenzielle Anti-Krebs-Arzneimittel-Abgabesystem erforscht. Kurz gesagt, Seide Kokons ersten Rückwärts durch Seide Auflösung von degumming die Kokons, gefolgt entwickelt und reinigen, um eine wässrige Lösung Seide zu erhalten. Als nächstes wird die regenerierte Seiden Lösung Nanopräzipitation zogen Seide Nanopartikel zu erhalten – eine einfache, aber leistungsfähige Methodedass erzeugt einheitliche Nanopartikel. Die Seiden Nanopartikel zeichnen sich dadurch nach ihrer Größe, das Zetapotenzial, die Morphologie und Stabilität in wässrigen Medien, sowie ihre Fähigkeit, ein chemotherapeutisches Nutzlast und töten menschlichen Brustkrebszellen einzuschließen. Insgesamt ergibt die beschriebene Methodik einheitliche Seiden Nanopartikel, die leicht für eine Vielzahl von Anwendungen untersucht werden können, einschließlich ihrer Verwendung als potentielles Nano.

Introduction

Nano-Größe Drug-Delivery-Systeme werden oft verwendet, Wirkstofffreisetzung zu steuern und eine vielfältige Reihe von therapeutischen Nutzlasten zu liefern – zum Beispiel Proteine, Peptide und kleine Molekulargewicht Drogen – Zellen und Gewebe zu zielen. Diese therapeutischen Nutzlasten werden oft in verschiedene makromolekulares Arzneimittelträger eingearbeitet, wie Liposome, wasserlösliche Polymere (einschließlich Dendrimere) und Mikro- und Nanopartikel ^1. Nanopartikel ( in der Regel in einem Größenbereich von 1 nm bis 1000 nm) werden als potenzielle Wirkstoffträger weit erforscht, vor allem für Anti – Krebs – Medikamentenabgabe ^2. Die erfolgreiche Einführung von Abraxane (120 nm großen Albumin-basierte Nanopartikel mit Paclitaxel beladen) in der klinischen Routine ³ hat das Feld katalysiert, so dass noch viele weitere Nanopartikel für Drug Delivery jetzt betreten klinischen Studien ^4. Solide Tumoren zeigen in der Regel schlechte Lymphdrainage und haben undichte Blutgefäße, was bedeutet, dass nanoparticles von bis zu 200 nm passiv zu diesen Tumoren nach intravenöser Verabreichung gezielt werden. Dieses passive Targeting Phänomen ist die erhöhte Permeabilität und Retention (EPR) Effekt genannt und wurde erstmals 1986 ⁵ angegeben. Der EPR – Effekt zu einer 50- bis 100-fache Erhöhung der Arzneimittelkonzentrationen im Tumor – Mikroumgebung für eine bestimmte Medikamentendosis führen kann , wenn die Droge Nutzlast ist ein hochmolekulares Wirkstoffträger-Ansatz, anstatt die freie Arzneimittel ohne Träger geliefert. Drug beladene Nanopartikel für Anti – Krebs – Medikamentenabgabe entwickelt haben den Tumor – Mikroumgebung zu erreichen und oft muss eine bestimmte intrazelluläre Kompartiment, in der Regel durch endocytic Aufnahme eingeben, für das Medikament seine gewünschten therapeutischen Effekt ³ zu erzielen. Nanopartikel die für intrazelluläre Arzneimittelabgabe auszunutzen Endozytose als Gateway in die Zelle als auch einen Weg Arzneimittelresistenzmechanismen zu überwinden. Die Wirkstofffreisetzung von Nanopartikeln wird häufig speziell entwickelt, um oCCur in Lysosomen (dh lysosomotropes Arzneimittelabgabe) ⁶ , wobei der pH – Wert Ansprechverhalten des Nanopartikel – Träger (lysosomalen pH ca. 4,5) als Auslöser für die Wirkstofffreisetzung oder lysosomale Enzyme, die die Nutzlast von dem Träger ⁷ befreien dienen kann.

Viele unterschiedliche Klassen von Materialien können verwendet werden Nanopartikel zu erzeugen (beispielsweise Metallen und vielen organischen und anorganischen Materialien). Allerdings Biopolymere sind , sich als attraktive Materialien aufgrund ihrer bekannten Biokompatibilität, die biologische Abbaubarkeit und geringe Toxizität ^8. Viele Biopolymere werden erforscht, einschließlich Albumin, Alginat, Chitosan und Seide. Von diesen Seide hat sich als vielversprechende Anwärter für die Entwicklung in Systeme ⁹ Arzneimittelabgabe entstanden. Seiden verschiedener Typen werden durch eine Anzahl von Arthropoden hergestellt, einschließlich Spinnen (zB Nephila clavipes) und Seidenraupen (zB Bombyx mori). Silkworm Seide wird weit mehr exten verwendetlich als Spinnenseide, weil die Seidenraupe ist vollständig domestiziert und seine Seide stellt somit ein reproduzierbares Ausgangsmaterial. Silkworm Seide ist ein Food and Drug Administration (FDA) genehmigt Material für den menschlichen Gebrauch, insbesondere als Nahtmaterial; es verfügt über eine robuste Sicherheitsstandard bei Menschen und bekannt ist , ¹⁰ in vivo abzubauen. Der Abbauprofil von Seide kann fein abgestimmt werden von Stunden (niedrige kristalline Seide) zu 12 Monaten oder mehr (hohe kristalline Seide) zu reichen. Seidenabbauprodukte nicht toxisch sind und in dem Körper ¹⁰ metabolisiert. Die Seide Struktur verleiht die Fähigkeit , ¹¹ kleine molekulare Verbindungen und hochmolekularen Proteinwirkstoffen zu binden, ist es ein gutes Material für die kontrollierte Wirkstofffreisetzung zu machen. Protein Medikamente (zB Antikörper) sind anfällig für Denaturierung, Aggregation, proteolytische Spaltung und Clearance durch das Immunsystem. Allerdings Seide stabilisiert therapeutische Proteine ​​aufgrund der Pufferkapazität seiner nanokristallinem WiederRegionen und ihre Fähigkeit , Wassergehalt im Nanobereich ¹¹ anzupassen. Diese einzigartigen Eigenschaften bieten physischen Schutz und reduzieren Nutzlast Mobilität ¹¹ und sind in der Regel nicht mit anderen (Bio-) Polymeren gesehen. Viele Antikrebsarzneimittelabgabesysteme, zum Beispiel Seidenbasis Hydrogelen ^12, Folien ^13-15 und Nanopartikel ^16,17 haben nun diese Funktionen (besprochen in Referenzen ^18,19) zu nutzen , entwickelt

Hier Seide Nanopartikel wurden durch Bestimmung ihrer Größe und Ladung über einen längeren Zeitrahmen aus. Doxorubicin, eine klinisch relevante Anti-Krebs-Medikament, wurde als Modell Medikament zur Wirkstoffbeladung und Zytotoxizitätsuntersuchungen in triple negativen menschlichen Brustkrebszellen mit Wirkstoff beladenen Nanopartikel Seide behandelt verwendet.

Protocol

1. Herstellung eines Reverse-Engineering Silk – Lösung von Bombyx mori Cocoons HINWEIS: Diese Methode basiert auf Protokolle an anderer Stelle 12,27 beschrieben. Schneiden 5 g getrocknetes Kokons mit einer Schere in 5 mm x 5 mm große Stücke. Entfernen Sie alle verschmutzte Schichten. Man wiegt 4,24 g Natriumcarbonat und fügen Sie diese sorgfältig zu 2 l destilliertem Wasser kocht. HINWEIS: Dies ergibt eine 0,02 M Natriumcarbonat-Lösung. Fügen Sie d…

Representative Results

Die Daten wurden statistisch als detailliert zuvor 17 analysiert. Die t-Test nach Student wurde für die Probenpaare und Einwegvarianzanalyse (ANOVA), gefolgt von Bonferroni-Mehrfachvergleichs post-hoc-Test für mehrere Proben verwendet. Ein Sternchen bezeichnet eine statistische Signifikanz wie folgt: * P <0,05 und ** p <0,001. Alle Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung (SD) und die Zahlen in Klammern geben die Anzahl der unabhängigen Experimenten dargestell…

Discussion

Verschiedene Methoden stehen zur Verfügung Seide Nanopartikel zu erzeugen, einschließlich Polyvinylalkohol ²⁰ Mischen, Spray ²¹ Trocknen, Aussalzen ^22, Kapillare microdot ²³ Druck, überkritischem CO ₂ Fällung ²⁴ und Nanopräzipitation ^16,25 ( zusammengefasst in Bezug ^26). Allerdings Nanopräzipitation aufgrund seiner Gesamt Einfachheit ist die beliebteste Technik für Seide Nanopartikel zu erzeugen. Daher war das Ziel dieser Stud…

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system