シルクナノ粒子の製造および薬物送達アプリケーション

Summary

ナノ粒子は、適応症の広い範囲のための薬物送達システムを有望として浮上しています。ここでは、リバースエンジニアリングカイコの絹を使用して、絹のナノ粒子を製造するためのシンプルで強力な方法を記載します。これらの絹ナノ粒子は容易に治療的ペイロードとロードされ、その後、薬物送達用途のために探索することができます。

Abstract

絹は、その優れた機械的性質、生体適合性および生分解性、並びに保護及びその後のトリガに応答して、ペイロードを放出する能力の生物医学的及び医薬用途のための有望なバイオポリマーです。シルクは、様々な材料の形式に製剤化することができるが、絹ナノ粒子は、有望な薬物送達システムとして浮上しています。そこで、この記事では、安定したシルクのナノ粒子を生成するために使用することができます再生絹溶液を得リバースエンジニアリングの絹の繭のための手順を説明しています。これらのナノ粒子は、その後、薬物がロードされ、潜在的な抗癌薬物送達システムとして調査、特徴付けられます。簡単に言うと、絹の繭は逆の、繭を脱ガムすることにより、第1工学絹の溶解に続いて、水性シルク溶液を得、クリーンアップされています。次に、再生絹溶液は絹のナノ粒子を得るために、ナノ沈殿に供される – シンプルだが強力な方法それは、均一なナノ粒子を生成します。絹ナノ粒子は、そのサイズ、ゼータ電位、水性媒体中で形態および安定性、ならびに化学療法ペイロードを捕捉し、ヒト乳癌細胞を死滅させるそれらの能力に応じて特徴付けられます。全体的に、記載された方法は、潜在的なナノ医療としての使用を含む、容易に無数の用途のために検討することができます均一な絹ナノ粒子を、もたらします。

Introduction

細胞および組織を標的とする – 例えば、タンパク質、ペプチドおよび小分子薬物 – ナノサイズの薬物送達システムは、多くの場合、薬物放出を制御するために、および治療的ペイロードの多様なセットを提供するために使用されます。これらの治療のペイロードは、しばしば、リポソーム、（デンドリマーを含む）、水溶性ポリマー、およびマイクロおよびナノ粒子¹のような種々の高分子薬物担体に組み込まれています。 （典型的には1nm〜1000nmでのサイズ範囲の）ナノ粒子は、広く、特に抗癌薬物送達²ため、潜在的な薬物担体として検討されています。薬物送達のためのより多くのナノ粒子が、今の臨床試験^4に入っているように、日常の臨床実践³へのアブラキサンの導入に成功したが（120nmでのサイズのアルブミンベースのナノ粒子は、パクリタキセルでロード）、フィールドを触媒しました。固形腫瘍は、一般的に、そのn個を意味する貧しいリンパの流れを示し、漏出性血管を持っています200ナノメートルまでのanoparticlesは、受動的に静脈内投与後、これらの腫瘍を標的とすることになります。この受動的ターゲティング現象は、強化された透過性および保持（EPR）効果と呼ばれ、最初の1986年⁵で報告された。EPR効果が与えられた薬物用量場合の腫瘍微小環境内の薬剤濃度の50〜100倍の増加につながることができます薬物ペイロードは担体なしではなく、遊離薬物より高分子薬物担体アプローチを用いて送達されます。抗がん薬物送達のために設計された薬物担持ナノ粒子は、腫瘍微小環境に到達するために持っていると、薬物がその所望の治療効果^3を達成するためにするために、多くの場合、通常はエンドサイトーシス取り込みによって、特定の細胞内区画を入力する必要があります。細胞内薬物送達のために設計されたナノ粒子は、細胞へのゲートウェイ、ならびに薬物耐性メカニズムを克服するための経路として、エンドサイトーシスを利用します。ナノ粒子からの薬物放出は、しばしば、特にOに設計されていますリソソームにおけるccur（ すなわち 、リソソーム薬物送達）ナノ粒子のキャリア（リソソームpHは約4.5）のpH応答性薬物放出やキャリア⁷からペイロードを解放するリソソーム酵素のためのトリガーとして機能することができる^6。

材料の多くの異なるクラスは、ナノ粒子（ 例えば、金属および多くの有機及び無機材料）を生成するために使用することができます。しかし、生体高分子は、その既知の生体適合性、生分解性および低毒性⁸の魅力材料として浮上しています。多くの生体高分子は、アルブミン、アルギン酸塩、キトサン、シルクなど、探索されています。これらの中で、絹は、薬物送達システム⁹への開発のための有望な候補として浮上しています。様々な種類の絹は（ 例えば 、 カイコ ）（ 例えば 、Nephilaのclavipes）クモおよびカイコなどの節足動物の数、によって製造されています。カイコ絹ははるかにEXTENを使用されています、異常にクモの糸よりもカイコは完全に家畜化されているので、そのシルクは、このように再現可能な出発物質を表します。カイコ絹は、食品医薬品局（FDA）は、特に縫合材料として、ヒトへの使用のための材料を承認しています。それは、ヒトにおける強固な安全記録を有しており、 生体内 ¹⁰ で分解することが知られています。絹の分解プロフィールは、時間（低結晶性絹）から12ヶ月以上の範囲（高結晶性絹）に微調整することができます。シルク分解産物は非毒性であり、本体¹⁰に代謝されます。絹の構造は、薬物放出制御のための良い材料作り、低分子量化合物と高分子タンパク質薬^11を結合する能力を付与します。タンパク質薬剤（ 例えば、抗体）は、免疫系による変性、凝集、タンパク質分解的切断およびクリアランスを受けやすいです。しかし、シルクは、そのナノ結晶の再の緩衝能力に治療用タンパク質を安定化gionsナノスケール¹¹で水分含量を調整する能力。これらのユニークな機能は、物理的な保護を提供し、ペイロードモビリティ^11を削減し、典型的には、他の（バイオ）ポリマーでは見られません。例えば絹ベースのヒドロゲル^12、フィルム^13〜15ナノ粒子^16,17のための多くの抗癌薬物送達システムは、現在^（18,19参考文献に概説）、これらの機能を活用するために開発されています

ここで、絹のナノ粒子は、拡張された時間枠にわたってそのサイズと電荷を決定することによって特徴づけられました。ドキソルビシン、臨床的に関連する抗癌剤は、薬物装填絹ナノ粒子で処理したトリプルネガティブヒト乳癌細胞における薬物負荷および細胞毒性研究のためのモデル薬物として使用しました。

Protocol

カイコの繭からリバースエンジニアリングシルクソリューションの調製注：この方法は、他の場所12,27記載されているプロトコルに基づいています。 5ミリメートルのx 5ミリメートル片にハサミで乾燥繭の5グラムをカット。あらゆる汚れたレイヤーを削除します。 炭酸ナトリウムの4.24グラムを秤量し、蒸留水を沸騰の2 Lに慎重にこれを追加します。 ?…

Representative Results

以前に17に詳述するように、データを統計的に分析しました。スチューデントのt検定は、複数のサンプルについてボンフェローニの多重比較事後検定に続くサンプル対および一元配置分散分析（ANOVA）のために使用しました。次のようにアスタリスクは統計的有意性を示している：* P <0.05及び** P <0.001。すべてのデータは独立した実験の数を示す標準偏差?…

Discussion

種々の方法が^20をブレンド^するポリビニルアルコール、噴霧乾燥^21,22塩析、毛細管マイクロドット^23を印刷^し 、超臨界CO ₂沈殿^24（参照²⁶に概説）ナノ析出^16,25を含む、絹ナノ粒子を製造するために利用可能です。しかし、その全体的なシンプルさのために、ナノ析出は、絹のナノ粒子を生成するための最も人気の…

Materials

Acetone	VWR International, Radnor, PA, USA	20066.33
Automated Critical Point Dryer	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM CPD300
Balancing	Mettler Toledo, Greifensee, Switzerland	NewClassic MS
Black polystyrene microplate , 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3991
Capillary cell (DTS 1070)	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	DTS107
Carbon adhesive disc	Agar Scientific, Essex, UK	G3347N
Centrifuge	Hermle Labortechnik, Wehingen, Germany	Z323K
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Avanti J-E, Rotor: J20
Centrifuge	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	Optima L-70K, Rotor: 50.2 Ti, Adaptor 303392
Coater, low vacuum	Leica Microsystems, Wetzlar, Germany	EM ACE200
Cuvettes, polystyrene, disposable	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	FB55147
Doxorubixin	LC Laboratories, Boston, MA, USA	D4000
Electronic pipetting, Easypet	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
FE-SEM	Hitachi High-Technologies, Krefeld, Germany	SU6600
Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	16000-044
Freeze dryer	Martin Christ, Osterode, Germany	Epsilon 2-4
Heat inactivated Bombyx mori silk cocoons	Tajima Shoji, Kanagawa, Japan	N/A
Hotplate with Stirrer	Bibby Scientific, Stanffordshire, UK	US 152
Incubator	Memmert, Schwabach, Germany	INB 200
Insulin, human recombinant, zinc solution	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	12585-014
Lithium bromide	Acros Organics, Geel, Belgium	AC199870025
MDA-MB-231	ATCC, Manassas, VA, U.S.A	N/A
Micropipette and tips	Eppendorf, Hamburg, Germany	N/A
Microplate Reader	Molecular devices, Sunnyvale, CA, USA	SpectraMax M5
Oak Ridge High-Speed Centrifuge Tubes, 50 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	N/A
Open-Top Thickwall Polycarbonate tube, 4 ml	Beckman Coulter, Brea, CA, USA	355645
Penicilin/streptomycin	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	15140-122
RPMI medium	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	11875-093
Serological pipettes, 5 ml	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Silicon wafers	Agar Scientific, Essex, UK	G3391
Slide-A-Lyzer Dialysis cassettes, 3.5K MWCO, 15 ml	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	87724
Sodium carbonate anhydrous	Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	S/2840/62
Specimen stubs for SEM	Agar Scientific, Essex, UK	G301
Ultrasonic homogenizer	Bandelin, Berlin, Germany	Sonoplus HD 2070
UV transparent microplate, 96 well	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	3635
Vortex	IKA, Staufen, Germany	Genius 3
Zetasizer	Malvern Instrument, Worcestershire, UK	Nano ZS
Zetasizer Software version 7.11			DLS software
Micro Modulyo	Thermo Fisher	230	Freeze drying system