여기, 모듈형 DNA “장치” 어셈블리 액체 처리 로봇에 모듈형 복제 DNA 어셈블리 메서드를 사용 하 여 수행 하는 자동화 된 워크플로 제공 됩니다. 프로토콜 조합 DNA 장치 라이브러리 생성, 우리는 두 액체 처리 플랫폼을 사용 하 여 설명 하는 액체 처리기 선택 목록 생성 하기 위한 소프트웨어 도구를 사용 합니다.
모듈형 DNA 어셈블리 기술의 최근 발전 활성화 테스트를 합성 생물학의 사용할 수 있는 훨씬 더 많은 “디자인 공간” 개별 유전자 부품의 조합으로 만든 “장치”로 표현. 그러나, 장치 등 다 수의 수동 조립 시간, 오류 발생, 및 비용이 많이 드는입니다. 증가 세련 및 합성 생물학 연구의 대규모, 복잡 한, 그리고 높은 처리량 장치 건설을 수용 하는 효율, 재현 방법이 필요로 합니다.
여기, 형식이 IIS 기반 금지 endonuclease 모듈 (MoClo) 복제 기술을 사용 하 여 DNA 어셈블리 프로토콜은 두 액체 처리 로봇 플랫폼에 자동화 된다. 자동된 액체 처리 로봇 필요 주의 종종 지루한 최적화 pipetting 매개 변수 (예: 효소, DNA, 물, 버퍼), 다른 점도의 액체에 대 한 올바른 소망을 위해 명시적 프로그래밍 및 분배 DNA 부분 및 시 약. 이 수동 DNA 어셈블리로 문제가 복잡 한 어셈블리에 대 한 서 면 수동 스크립트 만들고 스크립트 생성을 자동화할 수 있는 소프트웨어 도구를 필요로 합니다. 이 위해 우리 은행 파일 업로드 기본 DNA 부분에서 조합 DNA 장치 라이브러리를 생성 하기 위한 http://mocloassembly.com 웹 기반 소프트웨어 도구를 개발 했습니다. 우리는 도구에 대 한 액세스를 제공 하 고 포함 하는 우리의 액체 처리기 소프트웨어에서 내보내기 파일 최적화 액체 클래스, 기구 매개 변수, 및 갑판 레이아웃. 사용 하는 모든 DNA 부분 Addgene을 통해 사용할 수 있으며, 그들의 디지털 지도 보스턴 대학 BDC 얼음 레지스트리를 통해 액세스할 수 있습니다. 함께, 이러한 요소는 자동화 모듈 복제 실험과 유사한 프로토콜을 다른 조직에 대 한 기초를 제공 합니다.
여기에 제시 된 자동화 된 DNA 어셈블리 워크플로 DNA 장치의 반복, 자동화, 높은 처리량 생산을 가능 하 게 하 고 반복적인 수동 pipetting에서 발생 하는 인간의 실수의 위험을 감소. 시퀀싱 데이터 표시 자동된 DNA 어셈블리가 워크플로에서 생성 반응 ~ 95% 정확 하 고 수동 반응 준비에 비해 약간 4% 많은 실습 시간으로 필요.
콜린스 토글 스위치1 과 Elowitz repressilator2 등 초기 합성 생물학 유전 장치 생물 학적 시스템 앞으로 구체적이 고 결정적인 기능을 설계 될 수 있는 시연 했다. 그 이후, 합성 생물학 바이오3, biotherapeutics4,5,6, 의 바이오 연료의 서비스에서 점차적으로 더 복잡 한 기능 수행을 생활 시스템 엔지니어를 노력가 78,,및 바이오 센 싱 응용 프로그램9,,1011. “장치”에 모듈형 DNA “부분”를 결합 하 여 특정 기능을 통해 이러한 응용 프로그램을 달성 합성 생물학의 주요 목표 중 하나 되었습니다. 규모,이 과정에 대 한 복잡 한 장치에는 시간 효율, 부품의 큰 도서관에서의 창조를 허용 하는 기술 해야 비용 효율적인, 그리고 가장 중요 한 것은, 재현 가능한 방식으로.
현재 필드 지도 성공적인 생물 학적 시스템 디자인과 구성 규칙의 완벽 한 이해 부족 하기 때문에 이러한 광대 한 조립 공정 보증 된다. 이것은 부족 하 게 특징이 DNA 부분12, 호환성의 부족과 부품13및 합성 장치14, 내에서 유전 구성 요소 간의 예기치 않은, 바람직하지 않은 상호 작용의 단계적 악화 15. 신뢰할 수 있는 예측 모델링의 부재, 기능 합성 유전자 장치 도착에 수만, 또는 심지어 수백, 입력-출력 신호 강도 의도 된 장치의 이체는 상영 및 “최고”의 요구는 시행 착오에 의해 다운스트림 요소16구성에 대 한 선택 됩니다. 현대 DNA 조립 방법 골든 게이트17및 모듈형 복제 등을 표준화 하는 동안18,,1920 쉽게이 과정, 실험 전문가 아직도 각 프로토콜을 수행 하는 데 필요한. 합성 장치 크기와 복잡성, 총 사용 가능한 디자인 공간에서 성장 될 것입니다 너무 크게 되 고21, 그리고 프로세스를 수동으로 테스트 것입니다 복제 분야에서 만들 수 있는 어떤 중요 한 진전에 대 한 너무 수 있습니다.
합성 생물학 및 생물학 부분 저장소 iGEM 부품 레지스트리 (http://partsregistry.org) 등의 출현까지 JBEI 인벤토리 구성 요소22, 그리고23, SynBioHub 유전자 부분에 저장 되지 했다 표준화 된 어셈블리 형식입니다. 부품의 단지 작은 한 줌 프로젝트, 복제 하는 데 필요한 및 따라서, 다 복제의 볼륨은 작은, 그리고 조립된 소자의 실현 달성 되었고 사소한 실제 연구 목표에 비해. 분자 클로닝 종종 임시 고 대신 어떤 표준화 된 프로세스에 따라 제한 사이트 및 endonuclease 가용성에 따라 제한 다이제스트를 사용 하 여 수행. 표준화의 부족 가능성이 다음 복제 반응 하는 동일한 프로토콜을 따를 것 이라고 했다 어떤 복제 프로토콜을 자동화 허무 했다. 또한, 정확한 개발 지침의 세대에 대 한 시간 투자 뿐만 아니라 필요한 장비 (로봇 및 관련된 소프트웨어 및 기구 인프라 처리 액체)에 상당한 금전적 투자 DNA 어셈블리를 자동화 처리 되 고 액체의 다양 한 클래스와 정확한 일련의 이러한 프로토콜을 실행 하는 지시를 처리 하기 위한 매개 변수입니다. 노력을 복제 하는 작은 규모가이 비용을 정당화 하지 않았다. 표준된 어셈블리 프로토콜24,25 와 결합 하는 더 크고, 더 복잡 한 유전 장치 디자인의 조합에서는 이러한 프로세스의 자동화 아주 실용적인 환경을 만듭니다. 26 Opentrons OT-1 처럼 저렴 한 비용 로봇 또한이 기술에 액세스할 수 심지어 겸손 투자 연구소 수 등장 하고있다. 또한, “구름” 실험실27 Transcriptic 및 에메랄드 클라우드 연구소 뿐만 아니라에 딘 버 러 게놈 주조, UIUC iBioFab 등 학문적 인 “biofoundries”를 포함 하 여 그리고 MIT 넓은 파운드리, 조립 다양 한 하네스 로봇 디자인의 세트 고객의 다양 한 신속 하 고 반복 하면서 미래 주문 조립 기술과 기본 DNA 프리미티브의 일반적인 저장소를 유지.
DNA 어셈블리의 과정 자동화에 가장 큰 과제 중 하나는 액체 처리기에 대 한 pipetting 명령의 세대입니다. 이러한 장치에 대 한 소프트웨어 인터페이스는 일반적으로 사용 하기 쉽게, 복잡 한 조합 DNA 어셈블리에 필요한 같은 pipetting 지침 명시적으로 각 aspirate를 지정 하 고 명령을 수동으로 분배 과학자가 필요 합니다. 이 주요 병목에서 워크플로 만들고 스크립트 생성 프로세스에 취약해 같은 pipetting 오류 경우 어셈블리를 수동으로 실시 했다. 이 pipetting 지침을 생성 하 여 연구원에 제공 하는 그들을 조립 하는 데 필요한 접시/시 설정으로 장치 라이브러리 디자인에서이 프로세스의 모든 부분을 자동화할 수 있는 소프트웨어 도구를 필요로 합니다. 이 작품에서는, 우리는 우리의 소프트웨어 도구는 작은 조합 DNA 장치 라이브러리의 디자인 뿐만 아니라 96 한 냄비 모듈형 DNA 어셈블리 반응으로 (버퍼, 물, 효소) 시 약 및 DNA 부분 (그림 1b)의 혼합을 자동화를 활용 합니다. 도구를 사용 하 여 이전 프로그래밍 경험이 필요 합니다, 확장 가능 하 고 높은 처리량, 그리고 기본적으로 조합. 우리는 반응 복제 준비 두 가지 다른 자동된 액체 처리 플랫폼에 항복 올바른 순서 확인 클론 반응 수동으로 준비 (95%)에 비해 주파수와 훨씬 적은 실습 시간 보여줍니다.
결론적으로, 프로세스의 자동화는 완전 한 DNA 장치 생성, 액체 처리, 철에서 디자인에서 기존의 현재 가능한 목표는 기술. 소프트웨어 및 현대 로봇, 시간 효율, 비용 효율적이 고 확장 가능한, 또한 수동 방법 보다 더 일관 되 게 재현할 수 결과 생산 하는 동안에 워크플로 만들을 수 있습니다. 자동화 프로토콜을 실행 하기 위한 가장 비용 효율적인 선택 항상 되지 않을 수 있습니다, 그것은 실험의 재현성을 향상지 않습니다 하 고 귀중 한 연구 시간을 확보. 그러나, 하드웨어 활용에 따라 자동화를 사용 하 여 구동할 수 있다 때로는 기존의 수동 방법을 통해 달성 될 수 있는 무슨 아래 실행 시간과 비용. 또한, 자동화는 공인한 방식으로 방지 특별, 수 제, 명시적으로 프로토콜 캡처하고 일화 좋습니다 실험을 기반으로 합니다. 여기 모듈형 DNA 장치의 자동된 조립 시연 되 고 프로토콜, 전자 파일, 그리고 실제 DNA 자원이 수행 하는 독자에 대 한 필요 하 고 비슷한, 자신의 실험 제공 됩니다. 우리의 도구의 가용성 우리 희망과이 프로토콜의 출판 자원으로 봉사 하 고 DNA 어셈블리 프로세스 및 액체 처리 로봇의 영역에 더 투명 하 고 공동의 미래를 향해 필드를 이동.
자동화 하드웨어의 유용성은 구성 및 하드웨어의 기능에 크게 의존 합니다. 예를 들어, 우리의 액체 처리기 aspirate 작용 및 명령 분배 시스템 유체 변위를 사용 합니다. 디트로이트 드라이브 시스템 유체는 상대적으로 큰 1 mL 주사기, 볼륨, 다양 한 유용한 시 약의 정확한 분배 2 µ L 낮은 제한을 부과. 결과적으로, 우리 반응 이후 20 µ L 액체 처리기에 설정 복제의 총 볼륨 축소 모든 명령 ≥2 µ L를 수 하는 데 필요한을 분배. 그러나이 효과적으로 그 반응을 실행 하는 데 필요한 실습 시간을 현저 하 게 감소 되었다 액체 처리기 준비 반응에 대 한 반응 당 비용을 두 배로. 이 문제를 해결 하기 위해, 우리는 모든 96 반응 음향 액체 디스펜서에 대 한 반응 설치를 반복. 이 장치 소리 에너지를 사용 하 여 다른 한 접시에서 직접 유체를 분배 하 고 달성할 수 있다 분배 볼륨까지 아래 (2.5 nL) 수동 펫을 기반으로 표준 공기 변위로 가능 하다. 이 장치를 사용 하 여, 우리는 250에 우리의 반응의 총 볼륨을 수 있었다 nL, 10 µ L의 수동으로 준비 반응에 비해 40-fold 감소. 적절 하 게, 작은 볼륨 pipetting 단계 사이의 팁 변경의 부족 때문에, 음향 디스펜서가 동일한 96 반응 시간에 생성할 수 (< 5 분). 이후 우리는 일반적으로 1-3 µ L 반응의 변환에 또한 작은 반응 볼륨 낭비 시 약에 저장 합니다. 그 말했다 하 고, 직관적인 소프트웨어와 함께에서 자동화 하드웨어를 사용 하 여 만들 수 있다 DNA 어셈블리 반응의 큰 숫자의 생성 훨씬 넓은 학문적 청중에 액세스할 수 있습니다.
그러나 여기, 우리 기능을 그것의 유용성을 확대 하는 데 도움이 될 수 있다 우리의 소프트웨어 도구 유틸리티를 보여 줍니다. 첫째, 조합 어셈블리를 생성 하는 도구를 사용할 때마다 새로운 DNA 부분 격판덮개 생성 되어야 합니다, 수동으로 실행 하는 모든 어셈블리에 대 한이 번호판을 과학자를 요구. 그것은 도움이 될, 대신, 과학자 어셈블리에 사용 되는 DNA 접시에서 부품의 위치를 지정할 수 있는 경우. 이 것이 DNA 정제 키트 연구원 수 CIDAR MoClo 라이브러리 같은 키트에서 문화를 접종 하 고 키트에 지정 된 각 부품의 잘 위치를 유지 하면서 모든 샘플을 함께 정화 높은 처리량 플라스 미드의 사용 허용. 둘째, 도구 현재 지원 96 잘 접시의 사용 합니다. 큰 프로젝트 몇 백 DNA 장치 건설 될 필요가, DNA, 시 약, 및 대상 접시의 수 액체 처리기의 덱 용량을 초과할 수 있습니다. 이 문제는 더 높은 밀도 플레이트 형식 384 (1536-잘)에 대 한 지원에 의해 적어도 부분적으로 완화 될, 수 있습니다. 마지막으로, 도구 현재 지원 단일 유형의 액체 처리기와 DNA 어셈블리 전략 합니다. 기본 지원으로의 적용 확대 크게 것 이다 많은 다른 액체 처리기 확장 하겠습니다 액체 처리기 도구 제작 지침 형식을 변환 하는 음향 디스펜서 스프레드시트 소프트웨어를 사용 하 여 상대적으로 쉬운 반면 다른 일반적인 DNA 조립 기술 호환성 깁슨 어셈블리31싶습니다.
이 자동화 된 어셈블리 생태계의 중요 한 부분 고급 어셈블리 계획 자동화 친화적인 프로토콜을 명시적으로 액체 처리 로봇에 실행 하도록 예약 된로 변환 하는 소프트웨어 도구 집합입니다. 다양 한 소프트웨어 도구가 어셈블리 철 Benchling, 레이븐32, MoClo 도우미, 등 디자인 연구를 허용 하는 존재, 비록 몇 가지 액체에서 실행 하려면 실행 명령으로 그 디자인을 변환 하는 기능 처리기입니다. 그 끝, 작업 홍보 홍보 자동화 및 인형33,,3435 이러한 도구를 사용할 수 있도록 하기 시작 했다와 같은. 또한, 상업 엔티티가이 지역에서 작업 자동화를 통해 최종 사용자의 큰 그룹에 실험 서비스를 제공 하는 “클라우드 연구소”를 소개 하는 방법을 찾고 있습니다. 이 문서에서 설명 하는 프로토콜은 이러한 노력 중의 조각 그들은 서비스로 제공 됩니다 제공 될 수 있습니다.
합성 생물학을 즉각적이 고 확실 한 값의 DNA 장치의 자동화 어셈블리를 실행 하는 동안 우리의 프로토콜은 뿐만 아니라 분자 생물학의 큰 지역 사회에 대 한 유용 합니다. DNA 어셈블리를 자동화 많은 알려진, 있지만 비슷한, 유전 장치 병렬 및 수 만들 수를 사용 검사 및 테스트 목적으로 약물 개발 연구에 대 한 식 라이브러리의 급속 한 합성. 우리의 소프트웨어 도구 노력 큰 조합 기반 DNA 어셈블리 더 접근 가능 하 고 모두는 합성 생물학으로 큰 학계에 유용한 자원으로 봉사 하겠습니다.
The authors have nothing to disclose.
우리 인형 프로젝트로 시스와 티어 카, 레이첼 스미스, 토마스 코스타에이 원고에 대 한 작업에 대 한 방출 Bhatia, Alejandro Pelaez 및 존슨 램 감사합니다. 이 작품은 NSF 경력에 의해 투자 되었다 수상 #1253856. 그것 또한 NSF 탐험 컴퓨팅 수상 # 1522074에 의해 자금이 다.
Hardware / Software | |||
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
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Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
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Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
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Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
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Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418–5418R-PF-9257.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Resources | |||
mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
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CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Labware | |||
50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers | |||
Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
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Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |