ويرد هنا، سير العمل الآلي لأداء وحدات الحمض النووي “الجهاز” الجمعية استخدام أسلوب الجمعية الحمض النووي وحدات استنساخ على الروبوتات مناولة السائل. يستخدم البروتوكول أداة برمجيات بديهية لتوليد قوائم معالج السائل لجهاز الحمض النووي اندماجي مكتبة الجيل، الذي نبدي باستخدام منصات مناولة السائل اثنين.
ومكنت التقدم الذي أحرز مؤخرا في وحدات الحمض النووي الجمعية تقنيات البيولوجيا التركيبية لاختبار أكثر بكثير من ال يتوفر تصميم الفضاء “” يمثلها “الأجهزة” التي تم إنشاؤها كمجموعات من العناصر الوراثية الفردية. ومع ذلك، الجمعية اليدوي لهذه الإعداد الكبيرة من الأجهزة مرة كثيفة وعرضه للخطأ، ومكلفة. ويقتضي تزايد تعقيد ونطاق بحوث البيولوجيا التركيبية بطريقة تتسم بالكفاءة، واستنساخه لاستيعاب بناء الجهاز واسعة النطاق ومعقدة وعالية الإنتاجية.
هنا، هو الآلي بروتوكول الجمعية الحمض النووي باستخدام تقنية “الاستنساخ وحدات” (موكلو) endonuclease القيد على أساس نوع IIS على اثنين من منصات السائل-المناولة الروبوتية. الآلي السائل-التعامل مع الروبوتات تتطلب حذراً، وكثير من الأحيان مملة التحسين من المعلمات بيبيتينج للسوائل اللزوجة المختلفة (مثل الإنزيمات، الحمض النووي، والمياه، المخازن المؤقتة)، فضلا عن برمجة واضحة لضمان تطلع صحيحة والاستغناء عن أجزاء الحمض النووي والمواد الكاشفة. وهذا يجعل البرنامج النصي دليل الكتابة لجمعيات معقدة فقط إشكالية كدليل الحمض النووي الجمعية، ويتطلب أداة برمجيات التي يمكن أتمتة إنشاء البرنامج النصي. وتحقيقا لهذه الغاية، قمنا بتطوير أداة لبرامج المستندة إلى الويب، http://mocloassembly.com، لتوليد اندماجي مكتبات جهاز الحمض النووي من أجزاء الحمض النووي الأساسية التي تم تحميلها كملفات بنك الجينات. نوفر إمكانية الوصول إلى الأداة، والأمثل ملف تصدير من برنامجنا معالج السائل الذي يشمل فئات السائل ومعلمات المختبرات الطبية وتخطيط سطح السفينة. تتوفر جميع أجزاء الحمض النووي المستخدمة عن طريق أدجيني، ويمكن الوصول إليها على الخرائط الرقمية عن طريق “التسجيل الجليد BDC جامعة بوسطن”. وتوفر هذه العناصر معا، أساسا للمنظمات الأخرى لأتمتة وحدات تجارب الاستنساخ وبروتوكولات مماثلة.
الآلي الحمض النووي الجمعية سير العمل المقدمة هنا يتيح إنتاج الأجهزة الدنا قابلة للتكرار، والآلي، والفائق، ويقلل من خطر الأخطاء البشرية الناجمة عن بيبيتينج اليدوية المتكررة. تسلسل إظهار البيانات المؤتمتة الحمض النووي الجمعية ردود الفعل التي ولدت من سير العمل هذا ~ 95% الصحيح وتتطلب قليلاً 4% كالتدريب العملي على كثير من الوقت، بالمقارنة مع إعداد الرد اليدوي.
الأجهزة الوراثية البيولوجية الاصطناعية أقرب مثل تبديل رمز التبديل كولينز1 و ريبريسيلاتور الويتز2 أظهرت أن النظم البيولوجية يمكن أن يكون هندسيا إلى الأمام لمهام محددة، والقطعية. ومنذ ذلك الحين، تسعى البيولوجيا التركيبية مهندس نظم المعيشة القيام بوظائف أكثر تعقيداً تدريجيا في خدمة الحيوية3،5،بيوثيرابيوتيكس،من46، الوقود الحيوي 78من،، وبيوسينسينج تطبيقات9،،من1011. تحقيق هذه التطبيقات من خلال الجمع بين وحدات الحمض النووي “أجزاء” في “الأجهزة” مع وظائف معينة كان واحداً من الأهداف الرئيسية للبيولوجيا التركيبية. لهذه العملية للقياس، يجب أن يكون هناك تقنية تسمح بإنشاء الأجهزة المعقدة من المكتبات الكبيرة لأجزاء الوقت-كفاءة وفعالة من حيث التكلفة، والأهم من ذلك، طريقة استنساخه.
عملية توسعية الجمعية له ما يبرره لأنه يفتقر حاليا إلى المجال فهم كامل للقواعد التي يسترشد بها في تصميم النظام البيولوجي ناجحة وتكوين. ويتفاقم هذا القدر الكافي تتسم الحمض النووي أجزاء12، عدم التوافق وكومبوسابيليتي من الأجزاء13، والتفاعلات غير متوقع أو غير مرغوب فيه بين المكونات الوراثية داخل الأجهزة الاصطناعية14، 15-في غياب النماذج التنبؤية موثوقة، وصلت الأجهزة الوراثية التركيبية الوظيفية بالتجربة والخطأ، الذي يطالب بعشرات أو حتى مئات، من قوة إشارة المدخلات والمخرجات هي فحص متغيرات جهاز المقصود و “أفضل” يتم تحديد تكوين مع عناصر المصب16. بينما الحديث توحيد أساليب الجمعية الحمض النووي مثل البوابة الذهبية17، و “استنساخ نموذجي”18،،من1920 جعل هذه العملية أسهل، خبير تجريبية لا تزال هناك حاجة القيام بكل بروتوكول. الأجهزة الاصطناعية تنمو في الحجم والتعقيد، والمساحة الإجمالية التصميم المتوفرة سوف تصبح كبيرة جداً لتشييد واختبار يدوياً21، وفي العملية ستكون الحرفي جداً لأي تقدم ملحوظ وقابلة للتكرار في الميدان.
حتى ظهور البيولوجيا التركيبية ومستودعات جزء البيولوجية مثل الحكومي “أجزاء التسجيل” (http://partsregistry.org)، لم يتم تخزين “المخزون جبيي من عناصر قابلة”22، و23من سينبيوهوب، الأجزاء الوراثية في أي تنسيق الجمعية الموحدة. سوى حفنة صغيرة من الأجزاء اللازمة لاستنساخ كل مشروع، وهكذا، كان حجم استنساخ عمله الصغيرة، وأعمال جهاز المجتمعين كان يمكن تحقيقه وتافهة بالمقارنة مع أهداف البحث الفعلي. الاستنساخ الجزيئي المخصصة في كثير من الأحيان وإجراء استخدام الملخصات تقييد يستند إلى تقييد توافر الموقع واندونوكليسي بدلاً من بعد أي عملية موحدة. عدم وجود توحيد جعلت من غير العملي أتمتة أي بروتوكول الاستنساخ كما أنه من غير المرجح أن تحذو رد فعل الاستنساخ المقبل بروتوكولا متطابقة. وعلاوة على ذلك، أتمتة الجمعية الحمض النووي المطلوب استثمارات نقدية كبيرة في المعدات (سائل التعامل مع الروبوتات وبنيتها التحتية برمجيات ومعدات المختبرات المرتبطة بها) فضلا عن استثمار الوقت لجيل الإرشادات لوضع دقيق معلمات للتعامل مع الفئات المختلفة من السوائل التي يجري تجهيزها وسلسلة دقيقة من الإرشادات لتشغيل هذه البروتوكولات. نطاق صغير استنساخ الجهود لا تبرر هذه النفقات. مزيج التصاميم أكبر حجماً وأكثر تعقيداً من الجهاز الوراثية مقترنا مع الجمعية توحيد البروتوكولات24،25 يخلق بيئة حيث أتمتة هذه العمليات عملية جداً. وظهرت الروبوتات منخفضة التكلفة مثل واحد بعد التمديد أوبينترونس26 أيضا الذي يسمح لمختبرات الممولة حتى متواضعة الوصول إلى هذه التكنولوجيا. وبالإضافة إلى ذلك، “سحابة” مختبرات27 بما في ذلك ترانسكريبتيك ومختبر سحابة الزمرد، فضلا عن الأكاديمية “بيوفوندريس” مثل “أدنبرة الجينوم مسبك”، إيبيوفاب UIUC، و “مسبك” واسع معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا، الروبوتات تسخير لتجميع مختلف مجموعات التصاميم لمجموعة متنوعة من العملاء بسرعة ومرارا وتكرارا أثناء صيانة مستودع مشترك للأوليات الحمض النووي الأساسية والتكنولوجيات الجمعية للطلبات المستقبلية.
واحدة من أكبر التحديات في أتمتة عملية تجميع الحمض النووي هو توليد الأوامر بيبيتينج لمعالج السائل. بينما واجهات برامج لهذه الأجهزة عادة سهلة الاستخدام، ومعقدة تتطلب تعليمات بيبيتينج مثل تلك اللازمة للجمعية الحمض النووي اندماجي الباحث تحديد كل أسبيراتي صراحة والاستغناء عن الأوامر يدوياً. هذا يخلق عقبة رئيسية في سير العمل، ويترك عرضه للأخطاء بيبيتينج نفس عملية تكوين البرنامج النصي كما لو نفذت الجمعية يدوياً. وهذا يتطلب أداة برمجيات التي يمكن أتمتة جميع أجزاء هذه العملية، من تصميم مكتبة الجهاز، إلى توليد التعليمات بيبيتينج، وتزويد الباحث بلوحة/كاشف الأجهزة المطلوبة لتجميع لهم. في هذا العمل، نحن نفوذ لدينا أداة البرمجيات لأتمتة تصميم مكتبة جهاز الحمض النووي اندماجي صغيرة، وكذلك خلط من الكواشف (المخزن المؤقت، والمياه، والأنزيمات) وأجزاء الحمض النووي (الشكل 1b) إلى 96 وعاء واحد وحدات الحمض النووي الجمعية ردود الفعل. استخدام الأداة لا يتطلب أي خبرة البرمجة السابقة، وهي قابلة للتطوير وعالية الإنتاجية، واندماجي بشكل افتراضي. نظهر أن استنساخ ردود الفعل أعد على منصات مختلفة من التعامل مع السائل الآلي اثنين استنساخ التحقق من التسلسل الصحيح العائد مع تردد مشابه لردود الفعل أعدت يدوياً (95%)، ومع أقل بكثير من الوقت العملي.
وفي الختام، التشغيل الآلي للحمض النووي جهاز إنشاء العملية الكاملة، من تصميم في السيليكون للتعامل مع السائل، هدف قابلة للبقاء مع القائمة حاليا التكنولوجيا. البرمجيات والروبوتات الحديثة تسمح بإنشاء مهام سير العمل التي تكون فعالة من حيث التكلفة والوقت فعالة، وقابلة للتطوير، بينما تنتج نتائج استنساخه باستمرار أكثر من الأساليب اليدوية أيضا. أثناء التشغيل الآلي قد لا يكون دائماً هو الخيار الأكثر فعالية من حيث التكلفة لتنفيذ بروتوكول، وهو تحسين إمكانية تكرار نتائج تجريبية وتحرر الباحث قيمة الوقت. ومع ذلك، اعتماداً على الأجهزة المستخدمة، استخدام أتمتة يمكن أحياناً محرك تكلفة ووقت تنفيذ أقل ما يمكن تحقيقه من خلال الأساليب اليدوية التقليدية. وعلاوة على ذلك، أتمتة يلتقط البروتوكولات صراحة في طريقة رسمية منع مخصصة، الحرفيين، والقصصية أفضل الممارسات القائمة على التجريب. هنا يتضح أن الجمعية الآلي لوحدات الحمض النووي الأجهزة، والبروتوكول، والملفات الإلكترونية، والموارد المادية من الحمض النووي اللازمة للقارئ لأداء هذه، وما شابه، يتم توفير تجارب على الخاصة بهم. أننا نأمل في توافر لدينا أداة، ونشر هذا البروتوكول سوف تكون بمثابة مورد ونقل الحقل نحو مستقبل أكثر شفافية والمجتمعية في مجال عمليات الجمعية الحمض النووي والسائل التعامل مع الروبوتات.
فائدة أجهزة التشغيل الآلي يعتمد إلى حد كبير على التكوين وقدرات هذه الأجهزة. على سبيل المثال، لدينا معالج السائل يستخدم نظام السوائل التشرد لتحفيز أسبيراتي والاستغناء عن الأوامر. الحقن بيستونز أن محرك أقراص النظام السائل 1 مل كبيرة نسبيا، بينما مفيدة لمجموعة من وحدات التخزين، يفرض حد أدنى 2 ميليلتر للاستغناء عن دقيقة من الكواشف. نتيجة لذلك، علينا الارتقاء بالحجم الإجمالي لاستنساخ ردود الفعل إعداد معالج السائل إلى 20 ميليلتر، منذ ذلك الحين كل الاستغناء عن الأوامر اللازمة لتكون إيه تو ميليلتر. هذا تضاعف فعالية التكلفة لكل رد فعل للسائل هيأهم معالج ردود الفعل، بيد أن التدريب العملي على الوقت المطلوب لتنفيذ تلك ردود فعل انخفضت انخفاضا كبيرا. في محاولة لمعالجة هذه المسألة، كررنا في إعداد رد فعل لجميع ردود الفعل 96 في عبوة سائل صوتية. هذا الجهاز يستخدم الطاقة السليمة للاستغناء عن السوائل مباشرة من لوح واحد إلى آخر، ويمكن أن يحقق الاستغناء عن كميات أقل بكثير (2.5 nL) ما هو ممكن مع التشرد الهواء القياسية على أساس الممصات اليدوية. باستخدام هذا الجهاز، تمكنا من خفض إجمالي حجم ردود الفعل لدينا 250 nL، تخفيض محاطاً بالمقارنة مع ردود الفعل معدّة يدوياً من 10 ميليلتر. بسبب أحجام صغيرة الاستغناء عن، وعدم وجود تغييرات تلميح بين الخطوات بيبيتينج، موزع الصوتية كانت قادرة على توليد نفس ردود الفعل 96 في جزء من الوقت (< 5 دقائق). حفظ أصغر حجم رد فعل أيضا على الكواشف مهدرة، حيث عادة ما نحول فقط 1-3 ميليلتر من رد فعل. أن يقال، استخدام أجهزة التشغيل الآلي للمكاتب، بالاقتران مع برامج بديهية، يمكن إتاحة توليد عدد كبير من ردود الفعل الجمعية الحمض النووي لجمهور أكاديمية أوسع.
هنا، علينا أن نظهر فائدة أداة البرمجيات لدينا، ولكن هناك عددا من الميزات التي ستساعد على توسيع فائدته. أولاً، في كل مرة يتم استخدام الأداة لإنشاء تجميع اندماجي، اللوحات جزء الحمض النووي الجديدة يجب إنشاء، تتطلب العلماء لتعبئة هذه اللوحات يدوياً للجمعية كل تشغيل. أنه من المفيد، بدلاً من ذلك، إذا كان الباحث يمكن تحديد موقع أجزاء في صفيحة الحمض النووي لاستخدامها في الجمعية العامة. وهذا ستسمح باستخدام بلازميد الفائق مجموعات تنقية الحمض النووي منذ الباحثين يمكن تطعيم الثقافات من أدوات مثل المكتبة موكلو السدر، وتنقية جميع العينات معا مع الحفاظ على الموقع جيدا لكل جزء محدد في المجموعة. وثانيا، الأداة حاليا يعتمد فقط استخدام لوحات 96-جيدا. قد يتجاوز عدد الحمض النووي، والكاشف، ولوحات الوجهة للمشاريع الأكبر فيها عدة مئات من أجهزة الحمض النووي بحاجة إلى أن يبني قدرة سطح معالج السائل. هذا يمكن، جزئيا على الأقل، التخفيف من حدة المشكلة بتقديم الدعم لتنسيقات لوحة الكثافة أعلى (384 أو 1536-جيدا). وأخيراً، الأداة حاليا يدعم فقط نوع واحد من معالج السائل واستراتيجية الجمعية الحمض النووي. وفي حين أنه من السهل نسبيا لتحويل تعليمات معالج السائل تنتج أداة لتنسيق موزع صوتية استخدام برامج جداول البيانات، ونأمل أن توسيع دعم أصلي للعديد من معالجات سائلة المختلفة التي كثيرا أن توسع نطاق تطبيقه، كما التوافق مع التقنيات الأخرى المشتركة في الجمعية الحمض النووي أن جيبسون الجمعية31.
جزء حاسم من هذا النظام الإيكولوجي الجمعية الآلي هو مجموعة من أدوات البرمجيات التي تترجم خطط الجمعية الرفيع المستوى إلى بروتوكولات الأتمتة ودية صراحة المجدولة لتشغيل على السائل التعامل مع الروبوتات. على الرغم من وجود عدد من أدوات البرمجيات التي تسمح للباحثين لتصميم التجميعات في السيليكون بما في ذلك بينتشلينج، ومخطط موكلو والغراب32، قليلة لديها القدرة على ترجمة تلك النماذج إلى إرشادات القابل للتنفيذ لتشغيل على سائل معالج. إلى أن ينتهي، وعمل مثل التشغيل الآلي للعلاقات العامة–العلاقات العامة والعرائس33،،من3435 قد بدأت لجعل هذه الأدوات متوفرة. وبالإضافة إلى ذلك، تبحث في سبل لإدخال “سحابة” المعامل التي توفر خدمات تجريبية لمجموعات كبيرة من المستخدمين النهائيين عن طريق التشغيل الآلي الكيانات التجارية العاملة في هذا المجال. يمكن أن يكون البروتوكول الواردة في هذه الورقة كما تقدم قطعة من أي من هذه الجهود وهي معروضة كخدمة.
أن الجمعية الآلي للحمض النووي من الأجهزة ذات قيمة مباشرة ووضوحاً للبيولوجيا التركيبية، فلدينا بروتوكول مفيد للمجتمع الأوسع من علماء البيولوجيا الجزيئية، وكذلك. أتمتة الجمعية الحمض النووي يسمح أعدادا كبيرة من المعروفة، ولكن أجهزة مماثلة، والوراثية المراد إنشاؤها في نفس الوقت ويمكن تمكين التوليف السريع من مكتبات التعبير للفحص والاختبار الأغراض في دراسات التنمية المخدرات. ونأمل أن لدينا أداة البرمجيات بذل جهود الجمعية أكبر الحمض النووي القائم على اندماجي أكثر يسرا، وموردا مفيداً لكلا البيولوجيا التركيبية، فضلا عن الأوساط الأكاديمية أكبر.
The authors have nothing to disclose.
ونحن نشكر سعود باتيا، أليخاندرو بيلايز، وجونسون لام للعمل على المشروع العرائس، فضلا عن صهيب كار وراشيل سميث، وتوماس كوستا للحصول على مساعدة مع هذه المخطوطة. ومولت هذا العمل الوظيفي NSF جائزة #1253856. كما يمول “الحملات جبهة الخلاص الوطني” في الحوسبة جائزة #1522074.
Hardware / Software | |||
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
|
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
|
Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
|
Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
|
Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418–5418R-PF-9257.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Resources | |||
mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
|
CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
|
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Labware | |||
50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers | |||
Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
||
Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |