Hier, wordt een geautomatiseerde workflow voor het uitvoeren van modulaire DNA “apparaat” vergadering met behulp van een modulaire klonen DNA vergadering methode op vloeistof aangestuurde robots gepresenteerd. Het protocol maakt gebruik van een intuïtieve softwaretool voor het genereren van vloeibare handler selectielijsten voor combinatorische DNA apparaat bibliotheek generatie, waaruit we met behulp van twee vloeibare behandeling platforms.
Recente vooruitgang in modulaire DNA vergadering technieken synthetische biologen te testen hebben ingeschakeld significant meer van de beschikbare “ontwerpruimte” vertegenwoordigd door ‘apparaten’ gemaakt als combinaties van individuele genetische componenten. Handmatige montage van dergelijke grote aantallen apparaten is echter tijdrovende vergissing-geneigd en kostbaar. De toenemende complexiteit en omvang van synthetische biologie onderzoek vereist een efficiënte, reproduceerbare manier aan grootschalige, complexe en hoge doorvoer apparaat bouw.
Hier, is een protocol van DNA vergadering met behulp van de Type-IIS-techniek voor het modulaire klonen (MoClo) van beperking endonuclease gebaseerd op twee vloeistof aangestuurde robotic platforms geautomatiseerd. Geautomatiseerde vloeistof-handling-robots vereisen zorgvuldige, vaak vervelend optimalisatie van pipetting parameters voor vloeistoffen van verschillende viscositeit (bijvoorbeeld enzymen, DNA, water, buffers), evenals de expliciete programmeren om juiste aspiratie en verstrekking van DNA onderdelen en reagentia. Dit maakt handmatige scriptschrijven voor complexe verzamelingen net zo problematisch als handmatige DNA vergadering, en vereist een softwaretool dat script generatie kunt automatiseren. Daartoe hebben we een web-gebaseerde softwaretool, http://mocloassembly.com, voor het genereren van combinatoriële DNA apparaatbibliotheken uit basisdelen DNA als Genbank bestanden geüpload. Wij bieden toegang tot het hulpprogramma, en een exportbestand van onze vloeibare handler software waarin geoptimaliseerd vloeibare klassen, labware parameters en dek lay-out. Alle gebruikte DNA-onderdelen zijn beschikbaar via Addgene, en hun digitale kaarten kunnen worden geraadpleegd via de Boston University BDC ICE register. Deze elementen vormen samen een basis voor andere organisaties om modulaire klonen experimenten en soortgelijke protocollen te automatiseren.
De geautomatiseerde DNA vergadering workflow hier gepresenteerd kan de productie van het herhaalbaar, geautomatiseerde, high-throughput DNA apparaten en vermindert het risico van menselijke fouten als gevolg van repetitieve handmatige pipetteren. Uit de gegevens blijkt de geautomatiseerde DNA vergadering reacties gegenereerd op basis van deze workflow ~ 95% correct zijn en vereisen weinig zo 4% als veel hands-on tijd sequencing, ten opzichte van handmatige reactie voorbereiding.
De vroegste synthetische biologische genetische apparaten zoals de tuimelschakelaar Collins1 en de Elowitz repressilator2 aangetoond dat biologische systemen naar voren kunnen worden ontworpen om specifieke, deterministische functies. Sindsdien, hebben synthetische biologen gestreefd om levende systemen te verrichten geleidelijk meer complexe functionaliteit in de service van biomaterialen3, biotherapeutics4,5,6, biobrandstoffen ingenieur 7,8, en biosensing toepassingen9,10,11. Verwezenlijking van deze toepassingen door het combineren van modulaire DNA “delen” in “apparaten” met specifieke functionaliteit is een van de belangrijkste doelen van synthetische biologie. Voor dit proces moet worden geschaald, moet er een techniek waarmee de oprichting van complexe apparaten van grote bibliotheken van onderdelen in een tijd-efficiënte, kostenefficiënte, en het belangrijkst, reproduceerbare manier.
Zulk een expansieve assemblage proces is gerechtvaardigd, omdat momenteel het veld ontbreekt voor een compleet begrip van de regels begeleiden succesvol biologische systeem constructie en de samenstelling. Dit wordt verergerd door onvoldoende gekarakteriseerd DNA delen12, gebrek aan compatibiliteit en combineerbaarheid van delen13, en onverwachte, ongewenste interacties tussen genetische componenten binnen synthetische apparaten14, 15. bij gebrek aan betrouwbare voorspellende modellen, functionele synthetische genetische apparaten zijn aangekomen bij door trial and error, waarin wordt gevraagd om tientallen of zelfs honderden, input-output signaalsterkte varianten van een beoogde apparaat zijn gescreend en de “beste” is geselecteerd voor samenstelling met stroomafwaartse elementen16. Terwijl de moderne gestandaardiseerd DNA vergadering methoden zoals Golden Gate17en modulaire klonen maken18,19,20 dit proces gemakkelijker, een experimentele expert is nog steeds vereist voor het uitvoeren van elk protocol. Synthetische apparaten groeien in omvang en complexiteit, de totale beschikbare ontwerpruimte zal te groot geworden voor het bouwen en testen handmatig21, en het proces zullen ook ambachtelijke voor elke aanzienlijke vooruitgang die repliceerbaar worden gemaakt in het veld is.
Tot de komst van synthetische biologie en biologische deel repositories zoals de iGEM delen register (http://partsregistry.org), werden de JBEI voorraad van configureerbare elementen22en SynBioHub23, genetische delen niet opgeslagen in een de vergadering van de gestandaardiseerde indeling. Slechts een kleine handvol onderdelen moesten worden gekloond per project, en zo het volume van het klonen gedaan was klein, en de realisatie van een geassembleerd apparaat was haalbaar en triviaal vergeleken met de werkelijke onderzoekdoelstellingen. Moleculaire klonen was vaak ad hoc en uitgevoerd met behulp van restrictie digests gebaseerd op de site en endonuclease beschikbaarheid beperking in plaats van na afloop van een gestandaardiseerde proces. Het gebrek aan standaardisatie maakte het onpraktisch voor het automatiseren van alle klonen protocollen zoals het was onwaarschijnlijk dat de volgende klonen reactie een identieke protocol zou volgen. Bovendien, automatiseren DNA vergadering vereist aanzienlijke monetaire investeringen in apparatuur (vloeibaar behandeling van robots en de bijbehorende software en labware infrastructuur) alsook de tijdsinvestering voor de generatie van instructies om nauwkeurige parameters voor de behandeling van de verschillende klassen van vloeistoffen wordt verwerkt en de precieze reeks instructies voor het uitvoeren van deze protocollen. Kleinschalige klonen inspanningen deed geen rechtvaardiging voor deze kosten. De combinatie van grotere, meer complexe genetische apparaat ontwerpen in combinatie met de vergadering van de gestandaardiseerde protocollen24,25 creëert een omgeving waar de automatisering van deze processen zeer praktisch is. Low-cost robotica zoals de Opentrons OT-One26 zijn ook in opkomst waardoor zelfs bescheiden gefinancierde laboratoria voor toegang tot deze technologie. Bovendien, “cloud” laboratoria27 met inbegrip van Transcriptic, evenals Emerald Cloud Lab en academische “biofoundries” zoals de Edinburgh genoom Foundry, de UIUC iBioFab, en de MIT-brede Foundry, harnas robotica te monteren diverse sets met ontwerpen voor een verscheidenheid van klanten snel en herhaaldelijk terwijl het behoud van een gemeenschappelijke opslagplaats van fundamentele DNA primitieven en vergadering technologieën voor toekomstige orders.
Een van de grootste uitdagingen in het automatiseren van het proces van DNA vergadering is de generatie van de pipetting opdrachten voor de vloeibare-handler. Terwijl de interfaces van de software voor deze apparaten meestal makkelijk te gebruiken, complexe zijn vereisen pipetting instructies zoals die welke noodzakelijk zijn voor de combinatorische DNA vergadering de wetenschapper expliciet opgeven van elke aspirate en handmatig opdracht afzien. Dit maakt een grote knelpunt in de werkstroom, en laat het script generatie proces kwetsbaar voor dezelfde pipetting fouten als de vergadering handmatig werden uitgevoerd. Dit vereist een softwaretool dat alle delen van dit proces van het ontwerpen van de apparaatbibliotheek te genereren van de pipetting instructies, en de onderzoeker te voorzien van de plaat/reagens opstellingen moeten samenvoegen kunt automatiseren. In dit werk benutten we onze softwaretool voor het automatiseren van het ontwerp van een kleine combinatorische DNA apparaatbibliotheek, alsmede het mengen van de reagentia (buffer, water, enzymen) en delen van het DNA (Figuur 1b) in 96 één-pot modulaire DNA vergadering reacties. Gebruik van het hulpprogramma vereist geen voorafgaande programmeerervaring, is schaalbaar en hoge doorvoer, en combinatorische standaard. We laten zien dat klonen reacties bereid op twee verschillende geautomatiseerde liquid handling platformen opbrengst juiste volgorde-geverifieerd klonen met vergelijkbare frequentie reacties bereid handmatig (95%) en met aanzienlijk minder hands-on tijd.
Kortom, de automatisering van de volledige DNA apparaat creatieproces, van in silico ontwerp tot liquid handling, is een haalbaar doel met het momenteel bestaande technologie. Software en moderne robotica maken het van werkstromen die zijn kosten-efficiënte, tijd-efficiënte en schaalbare, terwijl ook het produceren van meer consequent reproduceerbare resultaten dan handmatige methoden. Hoewel automatisering misschien niet altijd de voordeligste keuze voor de uitvoering van een protocol, het verbetert experimentele reproduceerbaarheid en bevrijdt omhoog waardevolle onderzoeker tijd. Echter, afhankelijk van de hardware gebruikt, het gebruik van automatisering kan soms rijden kosten en uitvoeringstijd ver beneden wat kan worden bereikt door middel van conventionele handmatige methoden. Anderzijds automatisering vangt protocollen expliciet in een geformaliseerde manier voorkomen ad hoc, ambachtelijke, en anekdotische beste praktijken op basis van experimenten. Hier de geautomatiseerde vergadering van modulaire apparaten van DNA wordt aangetoond, en het protocol, elektronische bestanden, en fysieke middelen van DNA die nodig zijn voor de lezer om te voeren deze en soortgelijke experimenten op hun eigen worden meegeleverd. We hopen dat de beschikbaarheid van onze tool, en de publicatie van dit protocol zal dienen als een hulpbron en verplaats het veld naar een meer transparante en gemeenschappelijke toekomst op het gebied van DNA assemblage processen en de vloeistof verwerken robotica.
Het nut van automatisering hardware is grotendeels afhankelijk van de configuratie & mogelijkheden van die hardware. Bijvoorbeeld, onze vloeibare handler gebruikt systeem vloeistof verplaatsing actuate aspirate en afzien van opdrachten. De zuigers dat station de vloeistof systeem zijn relatief grote 1 mL spuiten die, terwijl nuttig voor een aantal volumes, legt een ondergrens van 2 µL voor nauwkeurige verstrekking van reagentia. Dientengevolge, wij opgeschaald naar het totale volume van het klonen van de reacties die zijn ingesteld op de vloeibare handler 20 µL, omdat elke opdracht moest worden ≥2 µL afzien. Dit verdubbeld effectief de kosten per reactie voor vloeibare handler-klaargestoomd reacties, maar de hoeveelheid hands-on tijd die nodig is om uit te voeren die reacties werd aanzienlijk teruggebracht. In een poging om dit probleem te verhelpen, herhaald wij de reactie setup voor alle 96 Reacties op een akoestische vloeistof dispenser. Dit apparaat maakt gebruik van geluid energie af te zien van vloeistof rechtstreeks uit één plaat naar de andere, en kunnen afzien van de volumes ver onder (2.5 nL) wat is mogelijk met standaard lucht verplaatsing gebaseerd handmatige pipetten. Het gebruik van dit apparaat, konden we aan het verkleinen van het totale volume van onze reacties op 250 nL, een 40-fold lager ligt dan handmatig bereid reacties van 10 µL. Vanwege de kleine volumes achterwege gelaten, en het ontbreken van tip veranderingen tussen pipetting stappen, de akoestische dispenser was in staat om het genereren van de dezelfde 96 reacties in een fractie van de tijd (< 5 min). De kleinere volumes van de reactie ook opslaan op verspilde reagentia, omdat doorgaans alleen we 1-3 µL van de reactie transformeren. Dat gezegd zijnde, kunt het gebruik van automatisering hardware, in combinatie met intuïtieve software, de generatie van grote aantallen DNA vergadering reacties toegankelijk maken voor een veel breder publiek van de academische.
We laten hier zien het nut van onze softwaretool, maar er zijn een aantal functies die zou helpen het nut ervan te verbreden. Eerst, telkens wanneer die het hulpprogramma wordt gebruikt voor het genereren van een combinatorische assemblage, nieuwe DNA deel platen moeten worden gegenereerd, waarbij de wetenschapper handmatig vullen deze platen voor elke vergadering worden uitgevoerd. Het zou daarentegen nuttig zijn als de wetenschapper kon Geef de locatie van onderdelen in een DNA-plaat om te worden gebruikt in de vergadering. Hierdoor zouden het gebruik van high-throughput plasmide DNA reiniging kits aangezien onderzoekers kon culturen uit een kit zoals de CIDAR MoClo-bibliotheek beënten, en te zuiveren van alle monsters samen met behoud van de goed locatie van elk onderdeel dat is opgegeven in de kit. Ten tweede, het hulpprogramma ondersteunt momenteel alleen het gebruik van 96-wells-platen. Voor grotere projecten waar verschillende honderd DNA-apparaten moeten worden gebouwd, kan het aantal DNA, reagens en bestemming platen de dek-capaciteit van de vloeibare handler overschrijden. Dit probleem kon worden, ten minste gedeeltelijk, verlicht door ondersteuning voor hogere dichtheid plaat formaten (384 of 1536-well). Ten slotte het hulpprogramma ondersteunt momenteel alleen een enkel type van vloeibare handler en DNA vergadering strategie. Hoewel het is relatief gemakkelijk de hulpprogramma-geproduceerde vloeibare handler instructies omzetten in een akoestische dispenser-formaat met behulp van spreadsheet-software, hopen we uit te breiden native ondersteuning aan vele verschillende vloeibare handlers die sterk de toepasbaarheid ervan, als verruimen zou wil de compatibiliteit met andere gemeenschappelijke vergadering technieken van DNA Gibson vergadering31.
Een cruciaal onderdeel van deze geautomatiseerde montage-ecosysteem is een set softwaretools die op hoog niveau vergadering plannen automatisering vriendelijke protocollen die expliciet zijn gepland vertaalt te lopen op vloeistof verwerken van robots. Hoewel een aantal softwaretools bestaan waarmee onderzoekers te ontwerpen van assembly’s in silico met inbegrip van Benchling, MoClo Planner en Raven32, hebben weinigen de mogelijkheid om deze ontwerpen te vertalen in uitvoerbare instructies uit te voeren op een vloeistof handler. Dat einde, werken zoals PR-PR automatisering en poppenspeler33,34,35 zijn begonnen deze hulpmiddelen ter beschikking te stellen. Commerciële organisaties werken in dit gebied bekijkt voorts manieren om “wolk labs” experimentele diensten aan grote groepen van eindgebruikers via automatisering verlenen. Het protocol beschreven in dit document kan dienen als een stuk van om het even welk van deze inspanningen bedoeld dat ze worden gepresenteerd als een service.
Terwijl geautomatiseerde samenstel van DNA voorzieningen van onmiddellijke en duidelijke waarde aan synthetische biologie is, is ons protocol handig voor de grotere Gemeenschap van moleculaire biologen ook. Automatiseren van DNA vergadering staat grote aantallen van bekende, maar soortgelijke, genetische apparaten gemaakt in parallel en kan inschakelen de snelle synthese van expressie bibliotheken voor screening en testdoeleinden in ontwikkelingsstudies van de drug. Wij hopen dat onze softwaretool zal grotere combinatorische gebaseerde DNA vergadering inspanningen toegankelijker te maken, en als een nuttige bron voor zowel de synthetische biologie, evenals grotere academische gemeenschap dienen.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Swapnil Bhatia, Alejandro Pelaez en Johnson Lam voor werk op de poppenspeler project, evenals Swati Carr, Rachael Smith en Thomas Costa voor hulp met dit manuscript. Dit werk werd gefinancierd door NSF carrière Award #1253856. Het wordt ook gefinancierd door de NSF expedities in Computing Award #1522074.
Hardware / Software | |||
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
|
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
|
Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
|
Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
|
Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418–5418R-PF-9257.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Resources | |||
mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
|
CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
|
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Labware | |||
50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers | |||
Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
||
Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |