स्वचालित रोबोट तरल हैंडलिंग मॉड्यूलर डीएनए उपकरणों की विधानसभा
Summary
यहां, एक स्वचालित कार्यप्रवाह मॉड्यूलर डीएनए प्रदर्शन करने के लिए “उपकरण” विधानसभा तरल हैंडलिंग रोबोट पर एक मॉड्यूलर क्लोनिंग डीएनए विधानसभा विधि का उपयोग कर प्रस्तुत किया है । प्रोटोकॉल मिश्रित डीएनए डिवाइस पुस्तकालय पीढ़ी, जो हम दो तरल हैंडलिंग प्लेटफार्मों का उपयोग कर प्रदर्शन के लिए तरल हैंडलर चयनसूची पैदा करने के लिए एक सहज ज्ञान युक्त सॉफ्टवेयर उपकरण का उपयोग करता है ।
Abstract
मॉड्यूलर डीएनए विधानसभा तकनीक में हाल ही में अग्रिमों सिंथेटिक जीव के लिए उपलब्ध “डिजाइन अंतरिक्ष” “उपकरणों” व्यक्तिगत आनुवंशिक घटकों के संयोजन के रूप में बनाया द्वारा प्रतिनिधित्व की काफी अधिक परीक्षण सक्षम है । हालांकि, उपकरणों की इतनी बड़ी संख्या के मैनुअल विधानसभा समय गहन, त्रुटि प्रवण, और महंगा है । बढ़ती परिष्कार और सिंथेटिक जीव विज्ञान अनुसंधान के पैमाने आवश्यक एक कुशल, प्रतिलिपि के लिए बड़े पैमाने पर समायोजित करने के लिए रास्ता, जटिल, और उच्च प्रवाह डिवाइस निर्माण ।
यहां, एक डीएनए असेंबली प्रोटोकॉल प्रकार-IIS प्रतिबंध endonuclease आधारित मॉड्यूलर क्लोनिंग (MoClo) तकनीक का उपयोग कर दो तरल पर स्वचालित है रोबोट प्लेटफार्मों से निपटने । स्वचालित तरल हैंडलिंग रोबोटों सावधान, अक्सर बार विभिंन viscosities के तरल पदार्थ के लिए pipetting मापदंडों के थकाऊ अनुकूलन (जैसे एंजाइमों, डीएनए, पानी, बफर), के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्पष्ट प्रोग्रामिंग सही आकांक्षा और वितरण सुनिश्चित करने की आवश्यकता डीएनए भागों और रिएजेंटों की । इस मैनुअल स्क्रिप्ट सिर्फ मैनुअल डीएनए विधानसभा के रूप में समस्याग्रस्त के रूप में जटिल विधानसभाओं के लिए लेखन, और आवश्यक एक सॉफ्टवेयर उपकरण है कि स्क्रिप्ट पीढ़ी को स्वचालित कर सकते है बनाता है । इस अंत करने के लिए, हम बुनियादी डीएनए Genbank फ़ाइलों के रूप में अपलोड भागों से मिश्रित डीएनए डिवाइस पुस्तकालयों पैदा करने के लिए एक वेब आधारित सॉफ्टवेयर उपकरण, http://mocloassembly.com, विकसित किया है । हम उपकरण के लिए उपयोग प्रदान करते हैं, और हमारे तरल हेंडलर सॉफ्टवेयर है जो तरल कक्षाएं, labware मानकों, और डेक लेआउट अनुकूलित शामिल है से एक निर्यात फ़ाइल । सभी डीएनए इस्तेमाल किया भागों Addgene के माध्यम से उपलब्ध हैं, और उनके डिजिटल नक्शे बोस्टन विश्वविद्यालय BDC बर्फ रजिस्ट्री के माध्यम से पहुंचा जा सकता है । साथ में, इन तत्वों को अंय संगठनों के लिए एक नींव मॉड्यूलर क्लोनिंग प्रयोगों और इसी तरह के प्रोटोकॉल को स्वचालित प्रदान करते हैं ।
स्वचालित डीएनए विधानसभा कार्यप्रवाह यहां प्रस्तुत दोहराया, स्वचालित, डीएनए उपकरणों के उच्च प्रवाह उत्पादन में सक्षम बनाता है, और मानव दोहराए मैनुअल pipetting से उत्पंन होने वाली त्रुटि के जोखिम को कम कर देता है । sequencing डेटा स्वचालित डीएनए विधानसभा प्रतिक्रियाओं इस कार्यप्रवाह से उत्पंन दिखा रहे है ~ ९५% सही है और के रूप में कम के रूप में 4% के रूप में ज्यादा हाथ समय पर, मैनुअल प्रतिक्रिया तैयारी की तुलना में की आवश्यकता होती है ।
Introduction
इस तरह के कोलिंस के रूप में जल्द सिंथेटिक जैविक आनुवंशिक उपकरणों टॉगल स्विच1 और Elowitz repressilator2 का प्रदर्शन किया है कि जैविक प्रणालियों के लिए विशिष्ट है, नियतात्मक कार्यों इंजीनियर हो सकता है । तब से, सिंथेटिक जीव के लिए जैव-भौतिक3,4,5,6की सेवा में उत्तरोत्तर अधिक जटिल कार्यक्षमता बाहर ले प्रणालियों के लिए रहने वाले इंजीनियर के लिए प्रयासरत है 7,8, और संवेदन आवेदन9,10,11. विशिष्ट कार्यशीलता के साथ “उपकरणों” में मॉड्यूलर डीएनए “भागों” संयोजन के माध्यम से इन आवेदनों को प्राप्त करने सिंथेटिक जीव विज्ञान के प्रमुख लक्ष्यों में से एक रहा है । इस प्रक्रिया के लिए पैमाने पर, वहां एक तकनीक है कि एक समय में भागों के बड़े पुस्तकालयों से जटिल उपकरणों के निर्माण, कुशल लागत कुशल, और सबसे महत्वपूर्ण बात, प्रतिलिपि तरीके की अनुमति देता होना चाहिए ।
इस तरह के एक विशाल विधानसभा प्रक्रिया वारंट है क्योंकि वर्तमान में क्षेत्र सफल जैविक प्रणाली डिजाइन और संरचना मार्गदर्शक नियमों की पूरी समझ का अभाव है । यह अपर्याप्त विशेषता डीएनए भागों12, संगतता और भागों13के composability की कमी, और अप्रत्याशित, सिंथेटिक उपकरणों के भीतर आनुवंशिक घटकों के बीच14अवांछनीय बातचीत से बढ़ा है, 15. विश्वसनीय अनुमानित मॉडलिंग के अभाव में, कार्यात्मक सिंथेटिक जेनेटिक उपकरणों परीक्षण और त्रुटि है, जो दसियों, या भी सैकड़ों की मांग, एक इरादा डिवाइस के इनपुट-आउटपुट सिग्नल की शक्ति वेरिएंट के द्वारा पर आ रहे हैं और “सर्वश्रेष्ठ” 16बहाव तत्वों के साथ संरचना के लिए चुना जाता है । जबकि आधुनिक मानकीकृत डीएनए इस तरह के गोल्डन गेट17के रूप में विधानसभा तरीकों, और मॉड्यूलर क्लोनिंग18,19,20 इस प्रक्रिया को आसान बनाने के लिए, एक प्रयोगात्मक विशेषज्ञ अभी भी प्रत्येक प्रोटोकॉल प्रदर्शन करने के लिए आवश्यक है । सिंथेटिक उपकरणों के आकार और जटिलता में वृद्धि के रूप में, कुल उपलब्ध डिजाइन अंतरिक्ष का निर्माण और मैंयुअल रूप से परीक्षण के लिए बहुत बड़ा हो जाएगा21, और प्रक्रिया किसी भी महत्वपूर्ण प्रगति जो क्षेत्र में किया जा replicable है के लिए भी कारीगरी होगी ।
इस तरह के iGEM भागों रजिस्ट्री (http://partsregistry.org) के रूप में सिंथेटिक जीव विज्ञान और जैविक भाग खजाने के आगमन तक, Composable तत्वों की JBEI सूची22, और SynBioHub23, आनुवंशिक भागों में संग्रहीत नहीं किया गया किसी भी मानकीकृत विधानसभा प्रारूप । केवल परियोजना के प्रति क्लोन किया जा करने के लिए आवश्यक भागों की एक छोटी सी मुट्ठी भर है, और इस प्रकार, किया क्लोनिंग की मात्रा छोटा था, और एक इकट्ठे डिवाइस की प्राप्ति प्राप्त और तुच्छ वास्तविक अनुसंधान उद्देश्यों की तुलना में था । आणविक क्लोनिंग अक्सर तदर्थ था और प्रतिबंध साइट और endonuclease उपलब्धता के बजाय किसी भी मानकीकृत प्रक्रिया का पालन पर आधारित प्रतिबंध डाइजेस्ट का उपयोग कर प्रदर्शन किया । मानकीकरण की कमी यह किसी भी क्लोनिंग प्रोटोकॉल को स्वचालित करने के रूप में यह संभावना नहीं है कि अगले क्लोनिंग प्रतिक्रिया एक समान प्रोटोकॉल का पालन करेंगे अव्यावहारिक बना दिया । इसके अलावा, डीएनए विधानसभा स्वचालित उपकरणों में महत्वपूर्ण मौद्रिक निवेश की आवश्यकता (तरल हैंडलिंग रोबोट और उनके संबद्ध सॉफ्टवेयर और labware बुनियादी ढांचे) के रूप में अच्छी तरह के रूप में निर्देश की पीढ़ी के लिए समय निवेश के लिए सही विकसित तरल पदार्थ के विभिंन वर्गों से निपटने के लिए पैरामीटर्स संसाधित किया जा रहा है और इन प्रोटोकॉल को चलाने के लिए निर्देशों की सटीक श्रृंखला । छोटे पैमाने पर क्लोनिंग के प्रयासों ने इन खर्चों का औचित्य नहीं समझा. बड़ा, अधिक जटिल आनुवंशिक डिवाइस मानकीकृत विधानसभा प्रोटोकॉल के साथ युग्मित डिजाइन के संयोजन24,25 एक वातावरण बनाता है जहां इन प्रक्रियाओं के स्वचालन बहुत व्यावहारिक है । Opentrons OT की तरह कम लागत रोबोटिक्स-एक26 भी उभर रहे है जो भी मामूली प्रयोगशालाओं वित्त पोषित करने के लिए इस तकनीक का उपयोग की अनुमति देता है । इसके अलावा, “बादल” प्रयोगशालाओं27 सहित प्रतिलेखनीय और पन्ना बादल लैब के रूप में के रूप में अच्छी तरह से शैक्षिक “biofoundries” इस तरह के रूप में एडिनबर्ग जीनोम फाउंड्री, UIUC iBioFab, और एमआईटी-व्यापक फाउंड्री, दोहन रोबोटिक्स डिजाइन के विविध सेट को इकट्ठा करने के लिए ग्राहकों की एक किस्म के लिए जल्दी और बार-समय बुनियादी डीएनए आदिमयों और भविष्य के आदेश के लिए विधानसभा प्रौद्योगिकियों के एक आम भंडार बनाए रखने ।
डीएनए विधानसभा की प्रक्रिया को स्वचालित में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक है तरल हेंडलर के लिए pipetting आज्ञाओं की पीढ़ी । हालांकि इन उपकरणों के लिए सॉफ्टवेयर इंटरफेस आम तौर पर उपयोग करने के लिए आसान कर रहे हैं, मिश्रित डीएनए विधानसभा के लिए आवश्यक उन जैसे जटिल pipetting निर्देश वैज्ञानिक स्पष्ट रूप से प्रत्येक महाप्राण निर्दिष्ट करने और आदेश मैन्युअल रूप से वितरित करने की आवश्यकता. यह कार्यप्रवाह में एक बड़ी अड़चन पैदा करता है, और स्क्रिप्ट पीढ़ी की प्रक्रिया को एक ही pipetting त्रुटियों को कमजोर पत्तियों के रूप में अगर विधानसभा मैंयुअल रूप से किया गया । इस आवश्यक एक सॉफ्टवेयर उपकरण है कि इस प्रक्रिया के सभी भागों को स्वचालित कर सकते हैं, डिवाइस लाइब्रेरी डिजाइनिंग से, pipetting निर्देश पैदा करने के लिए, और प्लेट/एजेंट के साथ शोधकर्ता प्रदान करने के लिए उंहें इकट्ठा करने की आवश्यकता setups । इस काम में, हम एक छोटे मिश्रित डीएनए डिवाइस पुस्तकालय के डिजाइन को स्वचालित करने के लिए हमारे सॉफ्टवेयर उपकरण का लाभ उठाने, साथ ही साथ रिएजेंट के मिश्रण (बफर, पानी, एंजाइमों) और डीएनए भागों (आंकड़ा 1b) में ९६ १-पॉट मॉड्यूलर डीएनए विधानसभा प्रतिक्रियाओं. उपकरण का उपयोग कोई पूर्व प्रोग्रामिंग अनुभव की आवश्यकता है, स्केलेबल और उच्च प्रवाह है, और डिफ़ॉल्ट रूप से मिश्रित । हम बताते है कि क्लोनिंग दो अलग स्वचालित तरल हैंडलिंग प्लेटफार्मों पर तैयार प्रतिक्रियाओं को मैन्युअल रूप से तैयार प्रतिक्रियाओं को तुलनीय आवृत्ति के साथ सही अनुक्रम सत्यापित क्लोन उपज (९५%), और काफी कम हाथ समय पर के साथ ।
Protocol
Representative Results
Discussion
अंत में, पूर्ण डीएनए डिवाइस निर्माण प्रक्रिया के स्वचालन से, में-silico डिजाइन तरल हैंडलिंग के लिए, वर्तमान में मौजूदा प्रौद्योगिकी के साथ एक व्यवहार्य लक्ष्य है । सॉफ्टवेयर और आधुनिक रोबोटिक्स कार्यप्रवाह के निर्माण की अनुमति है कि लागत कुशल हैं, समय कुशल, और स्केलेबल, मैनुअल तरीके से भी अधिक लगातार प्रतिलिपि परिणाम का उत्पादन करते हुए । हालांकि स्वचालन हमेशा एक प्रोटोकॉल क्रियांवित करने के लिए सबसे अधिक लागत प्रभावी विकल्प नहीं हो सकता है, यह प्रयोगात्मक reproducibility में सुधार करता है और मूल्यवान शोधकर्ता समय को मुक्त कर देता है । हालांकि, इस्तेमाल किया हार्डवेयर पर निर्भर करता है, स्वचालन के उपयोग के लिए कभी भी लागत और निष्पादन के समय अच्छी तरह से नीचे क्या पारंपरिक मैनुअल तरीकों के माध्यम से प्राप्त कर सकते है ड्राइव कर सकते हैं । इसके अलावा, स्वचालन प्रोटोकॉल स्पष्ट रूप से एक औपचारिक रूप से तदर्थ, कारीगरी, और वास्तविक सबसे अच्छा अभ्यास आधारित प्रयोग को रोकने के तरीके में कब्जा । यहां मॉड्यूलर डीएनए उपकरणों की स्वचालित विधानसभा का प्रदर्शन किया है, और प्रोटोकॉल, इलेक्ट्रॉनिक फ़ाइलें, और शारीरिक डीएनए पाठक के लिए आवश्यक संसाधनों के लिए इन प्रदर्शन, और इसी तरह, अपने स्वयं के प्रयोगों पर प्रदान की जाती हैं । हम अपने उपकरण की उपलब्धता की उंमीद है, और इस प्रोटोकॉल के प्रकाशन के एक संसाधन के रूप में सेवा और डीएनए विधानसभा प्रक्रियाओं और तरल हैंडलिंग रोबोटिक्स के क्षेत्र में एक और अधिक पारदर्शी और सांप्रदायिक भविष्य की ओर क्षेत्र कदम होगा ।
स्वचालन हार्डवेयर की उपयोगिता काफी हद तक उस हार्डवेयर के विन्यास और क्षमताओं पर निर्भर है. उदाहरण के लिए, हमारे तरल हेंडलर अत्यधिक महाप्राण और आदेश वितरण के लिए प्रणाली द्रव विस्थापन का उपयोग करता है । पिस्टन कि प्रणाली तरल पदार्थ ड्राइव अपेक्षाकृत बड़े है 1 मिलीलीटर सीरिंज जो, जबकि मात्रा की एक सीमा के लिए उपयोगी, एक 2 µ एल रिएजेंट के सही वितरण के लिए कम सीमा लगाता है । एक परिणाम के रूप में, हम क्लोनिंग प्रतिक्रियाओं की कुल मात्रा 20 µ एल के लिए तरल हेंडलर पर स्थापित किया, के बाद से हर वितरण आदेश के लिए ≥ 2 µ एल की जरूरत है । यह प्रभावी ढंग से तरल हेंडलर के लिए प्रतिक्रिया प्रति लागत दोगुनी-prepped प्रतिक्रियाओं, लेकिन हाथों की राशि समय पर उन प्रतिक्रियाओं को निष्पादित करने की आवश्यकता काफी कम था । एक इस मुद्दे को संबोधित करने के प्रयास में, हम एक ध्वनिक तरल मशीन पर सभी ९६ प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया सेटअप दोहराया । इस उपकरण के लिए ध्वनि ऊर्जा का उपयोग करता है सीधे एक थाली से दूसरे के लिए द्रव वितरण, और वितरण मात्रा को प्राप्त कर सकते है (२.५ nL) क्या मानक वायु विस्थापन के साथ संभव है आधारित मैनुअल पिपेट । इस उपकरण का उपयोग करना, हम 10 µ एल की मैन्युअल रूप से तैयार प्रतिक्रियाओं की तुलना में २५० nL, एक ४० गुना कटौती करने के लिए हमारी प्रतिक्रियाओं की कुल मात्रा नीचे पैमाने करने में सक्षम थे छोटी मात्रा में तिरस्कृत, और pipetting चरणों के बीच टिप परिवर्तन की कमी के कारण, ध्वनिक मशीन समय के एक अंश में एक ही ९६ प्रतिक्रियाओं उत्पन्न करने में सक्षम था (< 5 min). छोटे प्रतिक्रिया की मात्रा भी व्यर्थ एजेंट पर बचाने के लिए, क्योंकि हम आम तौर पर केवल 1-3 µ प्रतिक्रिया के एल बदलने । कहा जा रहा है, स्वचालन हार्डवेयर का उपयोग, सहज ज्ञान युक्त सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में, डीएनए विधानसभा प्रतिक्रियाओं की बड़ी संख्या की पीढ़ी एक बहुत व्यापक अकादमिक दर्शकों के लिए सुलभ बना सकते हैं.
यहां, हम अपने सॉफ्टवेयर उपकरण की उपयोगिता का प्रदर्शन, लेकिन वहां सुविधाओं जो इसकी उपयोगिता को व्यापक बनाने में मदद मिलेगी की एक संख्या हैं । सबसे पहले, हर बार उपकरण एक मिश्रित विधानसभा उत्पंन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, नए डीएनए भाग प्लेटें उत्पंन किया जाना चाहिए, वैज्ञानिक की आवश्यकता को मैंयुअल रूप से हर विधानसभा चलाने के लिए इन प्लेटों आबाद । यह मददगार होगा, बजाय अगर वैज्ञानिक एक डीएनए थाली में भागों का स्थान निर्दिष्ट करने के लिए विधानसभा में इस्तेमाल किया जा सकता है । यह उच्च प्रवाह प्लाज्मिड डीएनए शोधन किट के उपयोग के बाद से शोधकर्ताओं CIDAR MoClo पुस्तकालय की तरह एक किट से संस्कृतियों लगाना सकता है, और सभी नमूनों को एक साथ शुद्ध जबकि प्रत्येक किट में निर्दिष्ट भाग के अच्छी तरह से स्थान को बनाए रखने की अनुमति होगी । दूसरा, उपकरण वर्तमान में केवल ९६ के उपयोग का समर्थन करता है-अच्छी तरह से प्लेटें । बड़ी परियोजनाओं के लिए जहां कई सौ डीएनए उपकरणों की जरूरत है बनाया, डीएनए की संख्या, रिएजेंट, और गंतव्य प्लेटों तरल हेंडलर की डेक क्षमता से अधिक हो सकता है । यह समस्या हो सकती है, कम से आंशिक रूप से, उच्च घनत्व प्लेट प्रारूपों (३८४ या १५३६-well) के लिए समर्थन द्वारा समाप्त । अंत में, उपकरण वर्तमान में केवल तरल हेंडलर और डीएनए विधानसभा रणनीति का एक प्रकार का समर्थन करता है । हालांकि यह अपेक्षाकृत आसान है उपकरण को बदलने के लिए एक ध्वनिक औषधि प्रारूप स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए तरल हेंडलर निर्देश का उत्पादन, हम कई अलग तरल संचालकों जो बहुत इसके लागू व्यापक होगा, के लिए देशी समर्थन का विस्तार आशा के रूप में गिब्सन विधानसभा31की तरह अंय आम डीएनए विधानसभा तकनीकों के साथ संगतता होगा ।
इस स्वचालित विधानसभा पारिस्थितिकी तंत्र का एक महत्वपूर्ण हिस्सा सॉफ्टवेयर उपकरण का एक सेट है कि स्वचालन अनुकूल प्रोटोकॉल है कि स्पष्ट रूप से तरल हैंडलिंग रोबोट पर चलने के लिए निर्धारित कर रहे है में उच्च स्तरीय विधानसभा योजनाओं का अनुवाद है । हालांकि सॉफ्टवेयर उपकरण के एक नंबर मौजूद है कि शोधकर्ताओं ने Benchling, MoClo नियोजक, और रेवेन३२सहित silico में विधानसभाओं डिजाइन करने की अनुमति है, कुछ निष्पादन योग्य निर्देश में उन डिजाइनों अनुवाद करने के लिए एक तरल पर चलाने की क्षमता है हैंडलर. कि अंत करने के लिए, पीआर-पीआर स्वचालन और कठपुतली३३,३४,३५ के रूप में काम करने के लिए इन उपकरणों को उपलब्ध कराना शुरू कर दिया है । इसके अलावा, वाणिज्यिक इस क्षेत्र में काम कर रहे संस्थाओं को “क्लाउड लैब्स” जो स्वचालन के माध्यम से अंत उपयोगकर्ताओं के बड़े समूहों के लिए प्रयोगात्मक सेवाएं प्रदान शुरू करने के तरीके देख रहे हैं । इस पत्र में उल्लिखित प्रोटोकॉल इन प्रयासों में से किसी के एक टुकड़े के रूप में सेवा कर सकते है बशर्ते वे एक सेवा के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं ।
जबकि डीएनए उपकरणों के स्वचालित विधानसभा सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए तत्काल और स्पष्ट मूल्य की है, हमारे प्रोटोकॉल के रूप में अच्छी तरह से आणविक जीव के बड़े समुदाय के लिए उपयोगी है । डीएनए विधानसभा स्वचालित ज्ञात की बड़ी संख्या की अनुमति देता है, लेकिन इसी तरह, आनुवंशिक उपकरणों समानांतर में बनाया जा सकता है और दवा विकास के अध्ययन में स्क्रीनिंग और परीक्षण प्रयोजनों के लिए अभिव्यक्ति पुस्तकालयों के तेजी से संश्लेषण को सक्षम कर सकते हैं । हमें उंमीद है कि हमारे सॉफ्टवेयर उपकरण बड़ा मिश्रित आधारित डीएनए विधानसभा के प्रयासों को और अधिक सुलभ बनाना होगा, और दोनों सिंथेटिक जीव विज्ञान के लिए एक उपयोगी संसाधन के रूप में सेवा, साथ ही बड़े शैक्षणिक समुदाय ।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस पांडुलिपि के साथ मदद के लिए स्वप्निल भाटिया, ऐलेजैंड्रो Pelaez, और जॉनसन लाम कठपुतली परियोजना पर काम के लिए, साथ ही स्वाति कैरयर, Rachael स्मिथ, और थॉमस कोस्टा के लिए धन्यवाद । इस काम को NSF करियर अवार्ड #1253856 ने वित्तपोषित किया था. यह भी कंप्यूटिंग पुरस्कार #1522074 में NSF अभियानों द्वारा वित्त पोषित है ।
Materials
| Hardware / Software | |||
| Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
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| Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
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| Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
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| Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
| MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
| ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
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| Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418–5418R-PF-9257.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Resources | |||
| mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
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| CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
| CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Labware | |||
| 50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
| 2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
| Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
| Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
| Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
| Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
| PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
| T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
| BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
| BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
| T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
| Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
| Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
| Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
| SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
| LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
| LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
| Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primers | |||
| Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
||
| Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
References
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