Her vises en automatisert arbeidsflyt utføre modulære DNA “enhet” montering med en modulær kloning DNA montering metode på flytende-håndtering roboter. Protokollen bruker en intuitiv programvareverktøy for å generere flytende handler picklists for kombinasjon DNA enheten biblioteket generasjon, som viser vi bruker to flytende håndtering plattformer.
Nylige fremskritt innen modulær DNA montering teknikker har aktivert syntetiske biologists teste betydelig mer de tilgjengelige “design space” representert ved “enheter” opprettet som kombinasjoner av genetisk komponentene. Manuell samling av så mange enheter er imidlertid tidkrevende, utsatt for feil og dyrt. Den økende raffinement og omfanget av syntetisk biologi forskning nødvendiggjør en effektivt, reproduserbare måte å imøtekomme store, komplekse og høy gjennomstrømning enhet bygg.
Her, er en DNA montering protokoll med Type IIS begrensning endonuclease basert modulære kloning (MoClo) teknikk automatisert på to væske-håndtering robot-plattformer. Automatisert væske-håndtering roboter krever forsiktig, ofte kjedelig optimalisering av pipettering parametere for væske av ulike viskositeter (f.eks enzymer, DNA, vann, buffere), samt eksplisitt programmering å sikre riktig aspirasjon og dispensing DNA deler og reagenser. Dette gjør manuell skriptet skrive for kompliserte samlinger bare så problematisk som manuell DNA montering og nødvendiggjør en Programvareverktøyet det kanne automatisere generering av skript. Dette har vi utviklet en web-basert Programvareverktøyet, http://mocloassembly.com, for å generere kombinasjon DNA enheten biblioteker fra grunnleggende DNA deler lastet opp som Genbank filer. Vi gir tilgang til verktøyet, og en eksportfil fra våre flytende hånd programvare som inkluderer optimalisert flytende klasser, labware parametere og dekk oppsett. Alle DNA deler brukes er tilgjengelig gjennom Addgene, og deres digitale kart kan nås via Boston University BDC ICE registret. Disse elementene utgjør sammen en stiftelse for andre organisasjoner til å automatisere modulære kloning eksperimenter og like protokoller.
Automatisert DNA samlingen arbeidsflyten presenteres her kan gjentas, automatisert, høy gjennomstrømming DNA-enheter og reduserer risikoen for menneskelige feil som oppstår fra repeterende manuelle pipettering. Sekvensering data viser automatisert DNA montering reaksjonene fra denne arbeidsflyten er ~ 95% korrekt og krever lite som 4% som mye hands-on tid, sammenlignet med manuell reaksjon forberedelse.
De tidligste syntetiske biologiske genetisk enhetene som Collins vippebryter1 og Elowitz repressilator2 vist at biologiske systemer kan bli frem konstruert for å ha bestemt, deterministisk funksjoner. Siden da har syntetiske biologists forsøkt å ingeniør levende systemer til å utføre stadig mer komplekse funksjoner i tjenesten av biologisk materiale3, biotherapeutics4,5,6, biodrivstoff 7,8, og biosensing programmer9,10,11. Oppnå disse programmene gjennom kombinere modulære DNA “deler” i “enheter” med spesifikk funksjonalitet har vært en av de viktigste målene for syntetisk biologi. For denne prosessen for å skalere, må det være en teknikk som tillater etablering av komplekse enheter fra store biblioteker av deler i en tidkrevende, kostnadseffektiv, og viktigst, reproduserbare måte.
Slike en ekspansiv monteringen berettiget fordi feltet mangler for tiden en fullstendig forståelse av reglene guiding lykkes biological systemdesign og komposisjon. Dette er forsterket av utilstrekkelig preget DNA deler12, mangel på kompatibilitet og composability deler13og uventede, uønsket interaksjon mellom genetisk komponentene i syntetisk enheter14, 15. i fravær av pålitelig prediktiv modellering, funksjonelle syntetiske genetisk enheter er ankom ved prøving og feiling, som krever titusener, eller selv hundrevis, input-output signalstyrke varianter av en beregnet enhet er vist og den “best” er valgt for komposisjon med nedstrøms elementer16. Mens moderne standardisert DNA montering metoder som Golden Gate17og modulære kloning gjøre18,19,20 denne prosessen enklere, ekspert eksperimentelle er fortsatt nødvendig for å utføre hver protokoll. Syntetisk enheter vokser i størrelse og kompleksitet, totalt tilgjengelig design plass vil bli for stor for å bygge og teste manuelt21og prosessen vil bli for artisanal for betydelig fremgang som er repliserbar gjøres i feltet.
Frem til syntetisk biologi og biologiske del repositories som iGEM deler registret (http://partsregistry.org), ble JBEI lager av Composable elementer22og SynBioHub23, genetisk delene ikke lagret i noen standardisert montering format. Bare en liten håndfull deler måtte bli klonet per prosjekt, og dermed volumet av kloning gjort var liten, og realisering av en samlet enhet var oppnåelig og trivielle forhold til faktiske forskning målene. Molekylær kloning var ofte adhoc og utført ved hjelp av begrensning fordøyer basert på begrensning området og endonuclease tilgjengelig i stedet for etter standardiserte prosesser. Mangelen på standardisering gjorde det upraktisk å automatisere noen kloning protokoll som det var usannsynlig at neste kloning reaksjonen vil følge en identisk protokoll. Videre nødvendig automatisere DNA montering betydelige økonomiske investeringer i utstyr (væske roboter og deres tilhørende programvare og labware infrastruktur) og bruke tid investeringen for generering av å utvikle nøyaktig parametere for håndtering av de ulike klassene av væsker behandles og presis rekke instruksjonene for å kjøre disse protokollene. Småskala kloning innsats ikke rettferdiggjøre disse utgiftene. Kombinasjonen av større, mer komplekse genetiske enheten design kombinert med standardiserte montering protokoller24,25 skaper et miljø hvor automatisering av disse prosessene er veldig praktisk. Lavpris robotikk som Opentrons OT-en26 er også nye som lar selv beskjedent finansiert labs til denne teknologien. I tillegg “cloud” laboratorier27 inkludert Transcriptic og Emerald Cloud Lab samt akademiske “biofoundries” som Edinburgh genomet støperi, UIUC-iBioFab og MIT-bred støperiet, sele robotikk å montere mangfoldig sett av design for en rekke kunder raskt og gjentatte ganger mens opprettholde et felles oppbevaringssted for grunnleggende DNA primitive og montering teknologi for fremtidige bestillinger.
En av de største utfordringene i å automatisere prosessen med DNA montering er generering av pipettering kommandoene for flytende behandleren. Mens programvare grensesnitt for disse enhetene er vanligvis enkel å bruke, komplekse krever pipettering instruksjoner som nødvendig for kombinasjon DNA montering forskeren eksplisitt angi hver leveringstanken og dispensere kommandoen manuelt. Dette skaper en alvorlig flaskehals i arbeidsflyten, og forlater skriptet Generasjonsprosessen utsatt for samme pipettering feilene som om samlingen ble utført manuelt. Dette nødvendiggjør en Programvareverktøyet det kanne automatisere alle deler av denne prosessen, designe enhetsbiblioteket, genererer pipettering instruksjonene og gir forskeren plate/reagensen oppsett må samle dem. I dette arbeidet utnytte vi vår programvareverktøy for å automatisere utformingen av en liten kombinasjon DNA enhetsbiblioteket, samt en blanding av reagenser (buffer, vann, enzymer) og DNA deler (figur 1b) inn 96 one-pot modulære DNA montering reaksjoner. Bruk av verktøyet krever ingen tidligere erfaring med programmering, er skalerbare og høy gjennomstrømning, og kombinasjon som standard. Vi viser at kloning reaksjoner forberedt på to forskjellige automatisert flytende håndtering plattformer i yield riktig sekvens-verifiserte kloner med sammenlignbare frekvens reaksjoner forberedt manuelt (95%), og med mindre hands-on tid.
Avslutningsvis automatisering av komplett DNA enheten etableringen prosessen, fra i-sili design flytende håndtering, er et levedyktig mål med aktuelle eksisterende teknologi. Programvare og moderne roboter tillate oppretting av arbeidsflyter som er kostnadseffektiv, tidseffektive og skalerbare, mens også produsere mer konsekvent reproduserbar resultater enn manuelle metoder. Mens automatisering ikke kan alltid være det mest kostnadseffektive valget for utfører en protokoll, det blir bedre eksperimentelle reproduserbarhet og frigjør verdifulle forsker tid. Imidlertid avhengig av maskinvaren utnyttes, kan bruk av automatisering noen ganger kjøre kostnader og utførelsestid godt under hva som kan oppnås gjennom konvensjonelle manuelle metoder. Videre automatisering fanger protokoller eksplisitt i et formelt hindre ad hoc, artisanal, og anekdotiske beste praksis basert eksperimentering. Her automatisk montering av modulære DNA enheter er demonstrert, og protokollen, elektroniske filer og fysiske DNA ressurser trengs for leseren å utføre disse og lignende, eksperimenter på egen hånd er gitt. Vi håper at vårt verktøy, og utgivelsen av denne protokollen vil tjene som en ressurs og flytter feltet mot en mer åpen og felles fremtid i DNA assembly prosesser og flytende håndtering robotikk.
Nytten av automatisering maskinvare er i stor grad avhengig av konfigurasjonen og egenskapene til maskinvare. For eksempel bruker våre flytende handler system væske forskyvning betjene leveringstanken og dispensere kommandoer. Stempler at stasjonen systemet væsken er relativt stor 1 mL sprøyter, mens nyttig for en rekke volumer, pålegger en 2 µL nedre grense for nøyaktig utlevering av reagenser. Som en konsekvens vi skalert opp det totale volumet av kloning reaksjoner satt opp på den flytende behandleren 20 µL, siden hver dispensere kommandoen måtte ≥2 µL. Dette doblet effektivt kostnaden per reaksjon for flytende hånd-prepped reaksjoner, men praktisk tiden som kreves for å utføre disse reaksjonene ble betydelig redusert. I et forsøk på å løse dette problemet, gjentok vi reaksjon oppsettet for alle 96 reaksjoner på en akustisk flytende dispenser. Denne enheten bruker lyden energi til å dispensere fluid direkte fra en plate til en annen, og kan oppnå dispensere volumer langt under (2,5 nL) Hva er mulig med standard air forskyvning basert manuell pipetter. Bruker denne enheten, kunne vi redusere det totale volumet av våre reaksjoner til 250 nL, en 40-fold reduksjon sammenlignet manuelt forberedt reaksjoner på 10 µL. På grunn av små volumer utlevert, og mangel på tips endringer mellom pipettering trinn, akustisk dispenser kunne generere samme 96 reaksjonene på en brøkdel av tiden (< 5 min). Mindre reaksjon volumene også lagre på bortkastet reagenser, siden vi vanligvis bare transformere 1-3 µL av reaksjonen. Som blir sagt, kan bruk av automatisering maskinvare, sammen med intuitiv programvare, gjøre generering av store antall DNA montering reaksjoner tilgjengelig for et mye større akademisk publikum.
Her viser vi nytten av vår Programvareverktøyet, men det er flere funksjoner som ville bidra til å utvide dens nytte. Først må hver gang verktøyet brukes til å generere en kombinasjon samling, nye DNA del plater genereres, krever forskeren manuelt fylle disse platene for hver samling kjøre. Det ville være nyttig i stedet hvis forskeren kan angi plasseringen til deler i en DNA plate i samlingen. Dette vil tillate bruk av høy gjennomstrømming plasmider DNA rensing kits siden forskere kan vaksinere kulturer fra et kit som CIDAR MoClo Library, og rense alle prøver sammen samtidig godt plasseringen av hver del som er angitt i pakken. Andre støtter verktøyet for tiden bare bruk av 96-brønns plater. For større prosjekter der flere hundre DNA enheter må bygges, overskride antall DNA, reagens og destinasjon plater dekk kapasiteten til den flytende handler. Dette problemet kan være, minst delvis, lette av støtte for høyere tetthet plate formater (384 eller 1536-vel). Til slutt, verktøyet støtter for tiden bare én type flytende handler og DNA montering strategi. Mens det er relativt enkelt å konvertere verktøyet-produsert flytende handler instruksjonene til en akustisk dispenser format ved hjelp av regneark, håper vi å utvide støtten til mange forskjellige flytende handlers som sterkt utvide brukbarheten, som ønsker kompatibilitet med andre vanlige DNA montering teknikker Gibson montering31.
En viktig del av dette automatisk montering økosystemet er et sett med verktøy som oversetter høyt nivå montering planer til automatisering vennlig protokoller som eksplisitt skal kjøre på flytende håndtering roboter. Selv om en rekke verktøy eksisterer som tillater forskere å designe samlinger i sili inkludert Benchling, MoClo planlegger og Raven32, har få evnen til å oversette disse design til kjørbare instruksjonene for å kjøre på en væske behandleren. Det ender, arbeid som PR-PR automatisering og dukketeater33,34,35 har begynt å gjøre disse verktøyene tilgjengelig. I tillegg ser kommersielle selskaper arbeider i dette området på måter å innføre “Sky labs” som gir eksperimentelle tjenester til store grupper av sluttbrukere via automatisering. Protokollen beskrevet i dette dokumentet kan tjene som en del av dette arbeidet følger de presenteres som en tjeneste.
Mens automatisk montering av DNA enheter er umiddelbar og åpenbare verdi til syntetisk biologi, er våre protokollen nyttig for større fellesskap av molekylære biologer også. Automatisere DNA montering tillater mange kjente, men like, genetisk enheter i parallell og kan aktivere rask syntesen av uttrykket biblioteker for screening og teste i narkotika utviklingsstudier. Vi håper at vår Programvareverktøyet vil gjøre større kombinasjon-baserte DNA montering innsats mer tilgjengelig, og tjene som en nyttig ressurs for både den syntetisk biologi, samt større akademiske fellesskapet.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Swapnil Bhatia, Alejandro Peláez og Johnson Lam for arbeid på dukketeater prosjektet, samt Swati Carr, Rachael Smith og Thomas Costa hjelp med dette manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av NSF karriere Award #1253856. Det er også finansiert av NSF ekspedisjoner i databehandling Award #1522074.
Hardware / Software | |||
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
|
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
|
Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
|
Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
|
Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418–5418R-PF-9257.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Resources | |||
mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
|
CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
|
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Labware | |||
50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers | |||
Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
||
Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |