Aqui, um fluxo de trabalho automatizado para realizar a montagem de “dispositivo” modular do DNA usando um método de montagem clonagem de DNA modular em robôs de manipulação de líquido é apresentado. O protocolo usa uma ferramenta de software intuitivo para gerar picklists líquido manipulador para combinatória DNA dispositivo biblioteca geração, que demonstramos usando duas plataformas de manipulação de líquidos.
Avanços recentes em técnicas de montagem modulares DNA permitiram biólogos sintéticos testar significativamente mais do que o disponível “espaço de design”, representado por “dispositivos” criados como combinações de componentes genéticos individuais. No entanto, montagem manual de tão grande número de dispositivos é demorada, sujeito a erros e dispendiosa. A crescente sofisticação e escala de investigação de biologia sintética necessita de uma forma eficiente e reprodutível para acomodar a construção do dispositivo em grande escala, complexa e alta taxa de transferência.
Aqui, um protocolo de montagem de DNA utilizando a técnica de clonagem Modular (MoClo) endonuclease de restrição com base tipo-IIS é automatizado em duas plataformas de robóticas de manipulação de líquido. Robôs automatizados de manipulação de líquido requerem cuidado, muitas vezes tediosa otimização dos parâmetros de pipetagem de líquidos de viscosidades diferentes (por exemplo, enzimas, DNA, água, amortecedores), bem como programação explícita para garantir a correta aspiração e dispensação de partes do DNA e de reagentes. Isto faz manual script escrever para assemblies complexos tão problemáticos como montagem manual do DNA e necessita de uma ferramenta de software que pode automatizar a geração de script. Para este fim, nós desenvolvemos uma ferramenta de software baseado na web, http://mocloassembly.com, para gerar bibliotecas de dispositivo de DNA combinatórias de partes básicas do DNA carregadas como arquivos do Genbank. Nós fornecemos acesso à ferramenta, e um arquivo de exportação de nosso software líquido manipulador que inclui otimizado classes líquidas, labware parâmetros e layout do convés. Todas as peças de DNA utilizadas estão disponíveis através de Addgene, e seus mapas digitais podem ser acessados através do registro de gelo de BDC de Universidade de Boston. Juntos, esses elementos fornecem uma base para outras organizações automatizar a experimentos de clonagem modulares e protocolos semelhantes.
O DNA montagem fluxo de trabalho automatizado aqui apresentado permite a produção de alta produtividade, automatizada e repetível de dispositivos de DNA e reduz o risco de erro humano decorrentes de pipetagem manual repetitiva. Dados de sequenciamento mostram a montagem automatizada de DNA reações geradas a partir deste fluxo de trabalho são ~ 95% correta e exigir como pouco quanto 4% como hands-on muito tempo, em comparação com a preparação do manual de reação.
Os primeiros dispositivos genéticos biológicos sintéticos como o Collins interruptor1 e o Elowitz repressilator2 demonstraram que sistemas biológicos poderiam ser projetados para a frente para têm funções específicas, deterministas. Desde então, os biólogos sintéticos tenham me esforçado para engenheiro de sistemas vivos para realizar progressivamente mais complexa funcionalidade no serviço de biomateriais3, biotherapeutics4,5,6, de biocombustíveis 7,8e biosensing aplicações9,10,11. Alcançar estas aplicações através da combinação de DNA modular “peças” em “dispositivos” com funcionalidade específica tem sido um dos principais objetivos da biologia sintética. Para este processo de escala, deve haver uma técnica que permite a criação de dispositivos complexos de grandes bibliotecas de peças em um tempo-eficiente, custo-eficiente e mais importante, forma reprodutível.
Como um processo de montagem expansiva justifica-se porque atualmente o campo carece de um entendimento completo das regras orientadores sistema biológico bem sucedido design e composição. Isso é agravado por insuficientemente caracterizadas DNA partes12, falta de compatibilidade e capacidade de combinação de partes13e inesperadas, indesejáveis interações entre componentes genéticos dentro dispositivos sintéticos14, 15. na ausência de modelagem preditiva confiável, dispositivos genéticos sintéticos funcionais são chegou por tentativa e erro, que exige dezenas ou mesmo centenas de variantes de um dispositivo pretendido são selecionadas de intensidade do sinal de entrada-saída e o “melhor” é selecionado para a composição com elementos a jusante16. Enquanto moderno padronizados métodos de montagem de DNA como Golden Gate17e clonagem Modular18,19,20 facilitar esse processo, um perito experimental ainda é necessário para executar cada protocolo. Como dispositivos sintéticos crescem em tamanho e complexidade, o espaço total disponível projeto vai se tornar muito grande construir e testar manualmente,21e o processo será também artesanais para qualquer progresso significativo que é replicável para ser feita no campo.
Até o advento da biologia sintética e repositórios de parte biológica como o Medren peças registro (http://partsregistry.org), as inventário de elementos compostos de JBEI22e SynBioHub23, genéticas partes não foram armazenadas em qualquer formato de montagem padronizada. Apenas um pequeno punhado de peças necessárias para ser clonado por projeto e assim, o volume de clonagem feito era pequeno e a realização de um dispositivo montado era viável e trivial em comparação com os objectivos de investigação propriamente dita. Clonagem molecular foi muitas vezes ad hoc e executada usando sumários de restrição com base na disponibilidade de local e endonuclease de restrição, e não na sequência de qualquer processo padronizado. A falta de padronização tornou impraticável para automatizar qualquer protocolo de clonagem, como era pouco provável que a próxima reação de clonagem iria seguir um protocolo idêntico. Além disso, automatizar a montagem do DNA necessário investimento monetário significativo no equipamento (manuseio de líquidos robôs e sua infra-estrutura de software e equipamento laboratorial associada) bem como o investimento de tempo para a geração de instruções para desenvolver precisos parâmetros para lidar com as várias classes de líquidos sendo processadas e a série precisa de instruções para executar estes protocolos. Pequena escala clonagem esforços não justificar essas despesas. A combinação de projetos maiores, mais complexos dispositivo genético juntamente com montagem padronizada protocolos24,25 cria um ambiente onde a automatização destes processos é muito prática. Robótica de baixo custo como o Opentrons OT-One26 também estão emergindo que permite mesmo modestamente financiados labs para aceder a esta tecnologia. Além disso, a “nuvem” laboratórios27 , incluindo Transcriptic e laboratório de nuvem Esmeralda, bem como académico “biofoundries”, tais como a fundição de genoma de Edimburgo, o iBioFab UIUC, e a fundição do MIT-Broad, arnês robótica para montar diversos conjuntos de desenhos para uma variedade de clientes rapidamente e repetidamente enquanto manter um repositório comum de primitivos básicos do DNA e tecnologias de montagem para futuras encomendas.
Um dos maiores desafios em automatizar o processo de montagem do DNA é a geração dos comandos de pipetagem para o manipulador de líquido. Enquanto as interfaces de software para esses dispositivos são geralmente fáceis de usar, complexo pipetagem instruções como aqueles necessários para a montagem de DNA combinatória exigem o cientista explicitamente especificar cada aspirar e dispensar o comando manualmente. Isso cria um grande gargalo no fluxo de trabalho e deixa o processo de geração de script vulnerável aos erros de pipetagem mesmo como se o assembly foram realizado manualmente. Isto exige uma ferramenta de software que pode automatizar todas as partes deste processo, desde a concepção da biblioteca de dispositivo, para gerar as instruções de pipetagem e fornecendo o pesquisador com as configurações de placa/reagente necessárias para montá-las. Neste trabalho, alavancamos nossa ferramenta de software para automatizar o projeto de uma pequena biblioteca combinatorial de dispositivo de DNA, bem como a mistura dos reagentes (buffer, água, enzimas) e partes de DNA (Figura 1b) em 96 reações de montagem DNA modulares um pote. Uso da ferramenta não requer nenhuma experiência prévia de programação, é escalável e de alta produtividade e combinatória por padrão. Mostramos que clonagem reações preparado em duas plataformas diferentes manipulação automatizada de líquido clones de verificada a sequência correta de rendimento com frequência equivalente a reações preparado manualmente (95%) e com significativamente menos tempo hands-on.
Em conclusão, a automação do DNA dispositivo criação processo completo, desde a concepção no silico para manipulação de líquidos, é uma meta viável com atualmente existente tecnologia. Software e robótica moderna permitem a criação de fluxos de trabalho que são custo-eficiente, tempo-eficiente e escalável, enquanto também produzir mais resultados consistentemente reprodutíveis do que métodos manuais. Enquanto a automação não pode sempre ser a escolha mais econômica para a execução de um protocolo, ele faz melhorar a reprodutibilidade experimental e libera o tempo valioso do pesquisador. No entanto, dependendo do hardware utilizado, o uso de automação pode às vezes dirigir custo e tempo de execução bem abaixo do que pode ser conseguido através de métodos manuais convencionais. Além disso, automação capta protocolos explicitamente em uma maneira formalizada impedindo ad hoc, artesanal, e anedóticas melhores práticas com base em experimentação. Aqui a montagem automatizada de dispositivos modulares de DNA é demonstrada, e o protocolo, arquivos eletrônicos e recursos físicos de DNA necessários para o leitor a realizar estas e semelhantes, experiências por conta própria são fornecidas. Esperamos que a disponibilidade de nossa ferramenta, e a publicação do presente protocolo servirá como um recurso e mover o campo em direção a um futuro mais transparente e comunitário na área de processos de montagem de DNA e líquido manipulação robótica.
A utilidade de hardware de automação é largamente dependente da configuração & recursos de que hardware. Por exemplo, nosso manipulador de líquido usa deslocamento de fluidos sistema para accionar aspirado e distribuir comandos. Os pistões que o fluido do sistema de movimentação são relativamente grande 1 mL seringas que, embora útil para uma gama de volumes, impõe um limite inferior de 2 µ l para dosear com precisão dos reagentes. Como consequência, nós dimensionado o volume total da clonagem reações configurar no manipulador de líquido a 20 µ l, uma vez que cada comando preciso ser ≥2 µ l de dispensar. Isso efetivamente duplicou o custo por reação, para reações de manipulador-preparado líquidas, no entanto, a quantidade de tempo hands-on para a execução dessas reações foi significativamente reduzida. Em um esforço para resolver esse problema, repetimos a configuração de reação para todas as 96 reações em um distribuidor de líquido acústico. Este dispositivo usa a energia do som para dispensar fluido diretamente de uma placa para outra e pode conseguir dispensar volumes muito abaixo (2.5 nL) que é possível com o deslocamento de ar padrão baseado pipetas manuais. Usando este dispositivo, fomos capazes de reduzir o volume total de nossas reações a 250 nL, 40-fold redução em comparação com reações manualmente preparadas de 10 µ l. Devido os pequenos volumes dispensados e a falta de mudanças de ponta entre as etapas de pipetagem, o dispensador de acústico foi capaz de gerar as mesmas 96 reações em uma fração do tempo (< 5 min). Os menores volumes de reação também economizar em reagentes desperdiçados, já que normalmente apenas transformamos 1-3 µ l da reação. Sendo assim, o uso de hardware de automação, em conjunto com o software intuitivo, pode fazer a geração de um grande número de reações de montagem de DNA acessível para um público muito mais vasto acadêmico.
Aqui, vamos demonstrar a utilidade da nossa ferramenta de software, no entanto, existem uma série de características que ajudaria a ampliar sua utilidade. Em primeiro lugar, cada vez que a ferramenta é usada para gerar um assembly de combinatório, novas placas de parte do DNA devem ser geradas, exigir que o cientista preencher manualmente estas placas para cada assembly executar. Seria útil, em vez disso, se o cientista pode especificar a localização de peças em um prato de ADN para ser utilizado na montagem. Isso permitiria o uso do elevado-throughput do plasmídeo kits de purificação de DNA desde pesquisadores poderiam inocular culturas de um kit como o biblioteca de MoClo CIDAR e purificar todas as amostras juntas, mantendo o local bem de cada parte especificada no kit. Em segundo lugar, a ferramenta atualmente suporta apenas o uso de placas de 96 poços. Para projetos maiores, onde vários centenas dispositivos de DNA precisam ser construído, o número de DNA, reagente e placas de destino pode exceder a capacidade da plataforma do manipulador de líquido. Este problema poderia ser, pelo menos parcialmente, atenuado pelo suporte para formatos de placa de densidade mais elevados (384 ou bem-1536). Por último, a ferramenta atualmente suporta apenas um único tipo de manipulador de líquidos e a estratégia de montagem de DNA. Enquanto é relativamente fácil converter as instruções da ferramenta-produzido líquido manipulador em um formato acústico dispensador usando software de planilha, esperamos expandir o suporte nativo para muitos manipuladores de líquidos diferentes que seriam grandemente ampliar sua aplicabilidade, como compatibilidade com outras técnicas de montagem de DNA comuns gostaria de montagem Gibson31.
Uma parte crucial deste ecossistema de montagem automatizada é um conjunto de ferramentas de software que traduz-se planos de montagem de alto nível em protocolos de amigável de automação que são explicitamente programados para executar em robôs de manuseio de líquidos. Embora existem várias ferramentas de software que permitem aos pesquisadores projetar conjuntos em silico incluindo Benchling, MoClo planejador e Raven32, poucos têm a capacidade de traduzir esses desenhos em instruções executáveis para executar em um líquido manipulador de. Para que fim, trabalhar como PR-PR automação e marionetista33,34,35 começaram a disponibilizar essas ferramentas. Além disso, entidades comerciais, trabalhando nesta área estão procurando maneiras de introduzir “laboratórios de nuvem”, que fornecem serviços experimentais para grandes grupos de utilizadores finais através de automação. O protocolo descrito neste documento pode servir como um pedaço de qualquer um destes esforços fornecidos que são apresentados como um serviço.
Enquanto a montagem automatizada de dispositivos de DNA é de valor imediato e óbvio, a biologia sintética, nosso protocolo é útil para a comunidade de biólogos moleculares também. Automatizar a montagem do DNA permite que um grande número de conhecidos, mas dispositivos similares, genéticos para ser criado em paralelo e pode permitam a rápida síntese de bibliotecas de expressão para a seleção e para fins de teste em estudos de desenvolvimento de drogas. Esperamos que nossa ferramenta de software vai fazer maior baseado em combinatória DNA montagem os esforços mais acessível e servir como um recurso útil para tanto a biologia sintética, bem como maior comunidade acadêmica.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos Swapnil Bhatia, Alejandro Pelaez e Johnson Lam para trabalhar no projeto do titereiro, bem como Swati Carr, Rachael Smith e Thomas Costa para ajuda com este manuscrito. Este trabalho foi financiado pela NSF carreira prêmio #1253856. Também é financiado pelo NSF expedições em computação prêmio #1522074.
Hardware / Software | |||
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
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Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
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Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
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Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
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Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418–5418R-PF-9257.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Resources | |||
mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
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CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
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Name | Company | Catalog Number | Comments |
Labware | |||
50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers | |||
Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
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Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |