Här presenteras ett automatiserat arbetsflöde att utföra modulära DNA ”enhet” församlingen med en modulär kloning metod för DNA-församling på vätska-hantering robotar. Protokollet använder en intuitiv programvaruverktyg för att skapa flytande handler plocklistor för kombinatoriska DNA enhet biblioteket generation, som vi demonstrera med två vätskehantering plattformar.
Senaste framstegen inom modulära DNA monteringstekniker har aktiverat syntetiska biologer att testa betydligt mer tillgängliga ”design space” representeras av ”enheter” skapad som en kombination av individuella genetiska komponenter. Manuell montering av sådana stora mängder enheter är dock tidskrävande, tidskrävande och kostsamma. Den ökande sofistikering och skala av syntetisk biologi forskning kräver ett effektivt och reproducerbart sätt att rymma storskalig, komplexa och hög genomströmning konstruktion.
Här, är ett DNA församlingen protokoll med hjälp av modulära kloning (MoClo) typ-IIS begränsning Amiiiiin baserat-tekniken automatiserad på två vätska-hantering robotliknande plattformar. Automatiserad hantering av flytande robotar kräver noggrann, ofta gånger tråkiga optimering av pipettering parametrar för vätskor med olika viskositet (t ex enzymer, DNA, vatten, buffertar), samt explicit programmering att säkerställa rätt aspiration och dispensering av DNA delar och reagenser. Detta gör manuell skript skriver för komplexa sammansättningar bara är problematiska som manuell DNA-församling, och kräver ett verktyg som kan automatisera generering av skript. För detta ändamål har vi utvecklat en webbaserad programvaruverktyg, http://mocloassembly.com, för att generera kombinatoriska DNA enheten bibliotek från grundläggande DNA delar upp som Genbank filer. Vi tillhandahåller åtkomst till verktyget och en export-fil från vår flytande handler programvara som inkluderar optimerad flytande klasser, labware parametrar och däck layout. Alla DNA-delar som används är tillgänglig via Addgene och deras digitala kartor kan nås via Boston University BDC ICE registret. Tillsammans ger dessa element en grund för andra organisationer att automatisera modulära kloning experiment och liknande protokoll.
Automatiserad DNA församlingen arbetsflödet presenteras här möjliggör repeterbara, automatisk, hög genomströmning produktion av DNA-enheter, och minskar risken för mänskliga fel som härrör från repetitiva manuell pipettering. Sekvensering data visar den automatiserade DNA-församlingen reaktioner som genereras från detta arbetsflöde är ~ 95% korrekt och kräver som lite som 4% som mycket hands-on tid, jämfört med manuell reaktion förberedelse.
De tidigaste syntetiska biologiska genetiska enheterna såsom Collins omkopplaren1 och Elowitz repressilator2 visat att biologiska system fram kunde vara konstruerad för att ha specifika och deterministiska funktioner. Sedan dess har syntetiska biologer har strävat efter att ingenjör levande system att utföra successivt mer komplexa funktioner i tjänsten av biomaterial3, biotherapeutics4,5,6, biobränslen 7,8, och biosensing applications9,10,11. Att uppnå dessa program genom att kombinera modulära DNA ”delar” till ”enheter” med specifik funktionalitet har varit en av de stora målen för syntetisk biologi. För denna process att skala, måste det finnas en teknik som möjliggör skapandet av komplexa enheter från stora bibliotek med delar i en tidseffektiv, kostnadseffektiva, och viktigast av allt, reproducerbart sätt.
Sådan expansiv församling process är befogad eftersom fältet saknar för närvarande en fullständig förståelse av de regler som vägleder framgångsrikt biologiska systemdesign och komposition. Detta förvärras av otillräckligt kännetecknas DNA delar12, bristen på kompatibilitet och composability delar13och oväntade, oönskade interaktioner mellan genetiska komponenter inom syntetiska enheter14, 15. i avsaknad av tillförlitliga prognosmodeller, funktionella syntetiska genetiska enheter är anlände till genom trial and error, vilket kräver tiotals eller till hundratals, input-output signalstyrka varianter av en avsedd enhet screenas och den ”bäst” väljs för sammansättning med efterföljande element16. Medan modern standardiserade DNA montering metoder såsom Golden Gate17, och modulära kloning göra18,19,20 denna process enklare, en experimentell expert är fortfarande skyldig att utföra varje protokoll. Som syntetiska enheter växer i storlek och komplexitet, totala tillgängliga utformning utrymme kommer bli för stor för att bygga och testa manuellt21, och processen kommer att alltför hantverksmässiga för några betydande framsteg som är reproducerbart skall göras i fältet.
Fram till tillkomsten av syntetisk biologi och biologiska del databaser såsom iGEM delar registret (http://partsregistry.org) förvarades JBEI inventering av Composable element22och SynBioHub23, genetiska delar inte i någon standardiserad montering format. Endast en liten handfull delar behövs att klonas per projekt, och således kloning gjort var små, och förverkligandet av en monterad enhet var uppnåeligt och triviala jämfört med de faktiska forskningsmål. Molekylär kloning var ofta ad hoc- och utförs med begränsning smälter baserat på begränsning webbplats och Amiiiiin tillgänglighet snarare än efter någon standardiserad process. Avsaknaden av standardisering gjort det opraktiskt att automatisera kloning protokoll som det var osannolikt att nästa kloning reaktionen skulle följa ett identiskt protokoll. Dessutom krävs automatisera DNA-församling betydande monetär investering i utrustning (vätskehantering robotar och deras associerade programvara och labware infrastruktur) samt investeringen i tid för generering av instruktioner att utveckla korrekta parametrar för hantering av vätskor bearbetas de olika klasserna och exakt serie av instruktioner för att köra dessa protokoll. Liten skala kloning ansträngningar motiverar inte dessa kostnader. Kombinationen av större och mer komplexa genetiska enhet mönster tillsammans med standardiserad montering protokoll24,25 skapar en miljö där automatisering av dessa processer är mycket praktisk. Låg kostnad robotics som den Opentrons OT-ett26 framträder också som tillåter ännu blygsamt finansierade labs tillgång till denna teknik. Dessutom ”moln” laboratorier27 inklusive Transcriptic och Emerald Cloud Lab samt akademiska ”biofoundries” såsom Edinburgh genomet gjuteriet, den UIUC iBioFab, och MIT-breda gjuteriet, sele robotics att montera olika uppsättningar av mönster för en mängd olika kunder snabbt och upprepade gånger medan underhåll en gemensam informationsdatabas grundläggande DNA primitiver och montering teknik för framtida beställningar.
En av de största utmaningarna i att automatisera processen för DNA-församling är generation av pipettering kommandon för flytande hanteraren. Medan gränssnitt för dessa enheter är vanligtvis lätt att använda, komplexa kräver pipettering anvisningar som de nödvändiga för kombinatoriska DNA-församling forskaren att uttryckligen ange varje aspirera och expediera kommandot manuellt. Detta skapar en stor flaskhals i arbetsflödet, och lämnar script genereringsprocessen utsatta för samma pipettering fel som om församlingen utfördes manuellt. Detta kräver ett verktyg som kan automatisera alla delar av denna process, från att utforma enhetsbiblioteket, att generera pipettering instruktionerna, och ger forskaren plattan/reagens konfigurationer krävs att montera dem. I detta arbete utnyttjar vi vår programvaruverktyg för att automatisera utformningen av ett litet kombinatoriska DNA enhetsbibliotek samt blandning av reagenser (buffert, vatten, enzymer) och DNA delar (figur 1b) i 96 one-pot modulära DNA församlingen reaktioner. Verktyget kräver ingen tidigare erfarenhet av programmering, skalbar och hög genomströmning, och kombinatorisk som standard. Vi visar att kloning reaktioner beredd på två olika automatiserad vätskehantering plattformar avkastning rätt sekvens-verifierade kloner med jämförbar klockfrekvens till reaktioner beredd manuellt (95%), och med betydligt mindre hands-on tid.
Sammanfattningsvis, automatisering av komplett DNA enhet skapandeprocessen, från i-silico design till vätskehantering, är en livskraftig mål med befintliga teknik. Programvara och moderna robotics tillåter att skapa arbetsflöden som är kostnadseffektiv, tidseffektiv och skalbara, samtidigt också producerar mer konsekvent reproducerbara resultat än manuella metoder. Medan automation inte kan alltid vara det mest kostnadseffektiva valet för att köra ett protokoll, det förbättrar experimentell reproducerbarhet och frigör värdefull forskare tid. Dock beroende på hårdvaran utnyttjas, kan användning av automation ibland driva kostnaden och körningstid långt under vad som kan uppnås genom konventionella manuella metoder. Dessutom automation fångar protokoll uttryckligen i ett formaliserat sätt förebygga ad hoc, hantverksmässiga, och anekdotiska bästa praxis baserade experiment. Här automatiserad montering av modulära enheter som DNA är visat, och protokoll, elektroniska filer och fysiska DNA resurser behövs för läsaren att utföra dessa, och liknande, experiment på sina egna tillhandahålls. Vi hoppas tillgängligheten av vårt verktyg, och offentliggörandet av detta protokoll kommer att fungera som en resurs och flytta fältet mot en mer öppen och gemensam framtid i området av DNA församling processer och vätskehantering robotics.
Nyttan med automatisering hårdvara är till stor del beroende på konfiguration och funktioner i maskinvaran. Exempelvis använder våra flytande handler systemet flytande deplacement sättet att aspirera och fördela kommandon. Kolvarna att driva systemet vätskan är relativt stora 1 mL sprutor som, medan användbar för ett antal volymer, medför en 2 µL lägre gräns för korrekt dosering av reagenser. Som en följd vi dragit upp den totala volymen av kloning reaktioner ställa upp på flytande hanteraren 20 µL, eftersom varje avstå från kommandot behövde vara ≥2 µL. Detta fördubblades effektivt kostnaden per reaktion för flytande handler-prepped reaktioner, men mängden hands-on tid som krävs för att köra dessa reaktioner var signifikant reducerad. I ett försök att lösa problemet, upprepade vi den reaktion setup för alla 96 reaktioner på en akustisk flytande dispenser. Denna enhet använder ljudenergi för att dispensera vätskan direkt från en platta till en annan, och kan uppnå fördela volymer långt nedan (2.5 nL) vad som är möjligt med vanlig luft deplacement baserat manuella pipetter. Använder denna enhet vi kunnat skala ned den totala volymen av våra reaktioner på 250 nL, en 40-fold minskning jämfört med manuellt beredda reaktioner på 10 µL. På grund av små volymer dispenseras, och bristen på tip förändringar mellan pipettering steg, akustisk dispensern kunde generera samma 96 reaktioner i en bråkdel av tid (< 5 min). De mindre reaktion volymerna även Spara på bortkastade reagenser, eftersom vi vanligtvis bara omvandla 1-3 µL av reaktionen. Som sagt, kan användning av automation hårdvara, i samband med intuitiv programvara, göra generationen av stora mängder DNA församlingen reaktioner tillgängliga för en mycket bredare akademisk publik.
Här visar vi nytta av vår programvaruverktyg, men det finns ett antal funktioner som skulle hjälpa till att bredda dess användbarhet. Först, varje gång verktyget används till att generera en kombinatorisk församling, nya DNA del plattor måste genereras, som kräver vetenskapsmannen att manuellt fylla dessa plåtar för varje församling som kör. Det skulle vara användbart i stället om vetenskapsmannen kan ange platsen för delar i en DNA-tallrik för att användas i församlingen. Detta skulle tillåta användning av hög genomströmning plasmid DNA rening kit eftersom forskare kunde Inokulera kulturer från ett kit som CIDAR MoClo biblioteket, och rena alla prover tillsammans bibehållen väl platsen för varje del som anges i kit. Det andra stöder verktyget för närvarande endast användning av 96 brunnar. För större projekt där flera hundra DNA-enheter måste byggas, får antalet DNA, reagens och destination plattor överstiga däck kapaciteten för flytande hanteraren. Detta problem kan, åtminstone delvis, lindras genom stöd för högre densitet platta format (384 eller 1536-well). Slutligen stöder verktyget för närvarande endast en enda typ av flytande handler och strategi för DNA-församling. Det är relativt lätt att konvertera verktyg-producerade flytande handler instruktionerna till en akustisk dispenser format med kalkylprogram, hoppas vi att expandera inbyggt stöd till många olika flytande hanterare som kraftigt skulle bredda dess tillämplighet, som vill kompatibilitet med andra gemensamma DNA monteringstekniker Gibson församling31.
En avgörande del av denna automatiserad montering ekosystem är en uppsättning mjukvaruverktyg som översätter höga församlingen planer till automation vänliga protokoll som uttryckligen är schemalagda att köras på vätskehantering robotar. Även om det finns ett antal verktyg som tillåter forskare att utforma församlingar i-silico inklusive Benchling, MoClo Planner och Raven32, har få förmågan att översätta dessa formgivningar till körbara instruktioner att köra på en vätska handler. Att avsluta, arbetar som PR-PR Automation och dockspelare33,34,35 har börjat att göra dessa verktyg tillgängliga. Kommersiella enheter arbetar i detta område dessutom tittar på sätt att införa ”cloud labs” som ger experimentella tjänster till stora grupper av slutanvändare via automation. Protokollet beskrivs i detta dokument skulle kunna tjäna som en bit av någon av dessa insatser avses de presenteras som en tjänst.
Även automatiserad montering av DNA enheter är av omedelbar och uppenbart värde för syntetisk biologi, är våra protokoll användbart för större gemenskapen av molekylärbiologer samt. Automatisera DNA-församling tillåter ett stort antal kända, men liknande, genetiska enheter skapas parallellt och kan aktivera snabb syntesen av uttrycket bibliotek för screening och testning i drogen utvecklingsstudier. Vi hoppas att vår programvaruverktyg kommer att göra större kombinatoriska-baserad DNA församlingen ansträngningar mer tillgänglig, och tjäna som en användbar resurs för den syntetisk biologi, såväl som större akademiska världen.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Swapnil Bhatia, Alejandro Pelaez och Johnson Lam för arbete på dockspelare projektet, samt Swati Carr, Rachael Smith och Thomas Costa för hjälp med detta manuskript. Detta arbete finansierades av NSF karriär Award #1253856. Den finansieras också av NSF expeditioner i Computing Award #1522074.
Hardware / Software | |||
Freedom EVO 150 Liquid Handling Robot | Tecan | Custom liquid handler fitted with an 8-channel pipetting arm http://lifesciences.tecan.com/products/liquid_handling_and_robotics/freedom_evo |
|
Freedom EVOware Standard (Version 2.4 Service Pack 2) | Tecan | Software used to control the Freedom EVO 150 liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/software/freedom_evoware |
|
Echo 550 | Labcyte | Acoustic Liquid Dispenser http://www.labcyte.com/products/liquidhandling/echo-550-liquid-handler |
|
Sorvall Legend RT | Sorvall | Large benchtop swing-bucket sentrifuge | |
MasterCycler Pro | Eppendorf | 950040015 | Thermocycler with 96-well heat block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/PCR-44553/Cyclers-44554/Mastercycler-pro-PF-5193.html |
ECHOTHERM Chilling/Heating Dry Bath | Torrey Pines Scientific | Heating/Chilling block for EVO 150 deck https://www.torreypinesscientific.com/products/chilling-and-heating-dry-baths/echotherm-ric20-series-remote-controlled-chillingheating-dr |
|
Tabletop Microcentrifuge 5418 | Eppendorf | 5418000017 | Stardard 18-well microcentrifuge https://online-shop.eppendorf.com/OC-en/Centrifugation-44533/Centrifuges-44534/Centrifuges-5418–5418R-PF-9257.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Resources | |||
mocloassembly.com | Lattice Automation | Web-tool for combinatorial DNA assembly mocloassembly.com |
|
CIDAR MoClo Parts Kit | AddGene | 1000000059 | Kit of bacterial glycerol stocks for all DNA parts used in this study https://www.addgene.org/cloning/moclo/densmore/ |
CIDAR ICE Registry | CIDAR Lab | Registry of plasmid DNA maps https://ice.cidarlab.org/folders/8 https://synbiohub.programmingbiology.org/public/bubdc_ice/bubdc_ice_folder_8/current |
|
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Labware | |||
50 μL Conductive Tips | Tecan | 30 057 818 | Sterile 50 μL conductive tips for Tecan liquid handler http://lifesciences.tecan.com/products/consumables/disposable_tips/liquid_handling_disposable_tips |
2 mL Deep 96-well Culture Plates | USA Scinetific | 5678-0285 | Bacterial culture plates used for culturing of large numbers of samples http://www.thermoscientific.com/en/product/nunc-1-3-2-0ml-deepwell-plates-shared-wall-technology.html |
1.5 mL Microcentrifuge Tubes | USA Scinetific | 1615-5599 | Disposable microcentrifuge tubes http://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube-colors.aspx |
Breathe Easier sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Breathable sealing membrane for bacterial culture plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/z763624?lang=en®ion=US |
Full-Skirted, Low-Profile, 96-Well PCR Plates | GeneMate | T-3183-2 | PCR plates used for all steps https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-3183-R |
Alluminum Sealing Foil for PCR Plates | GeneMate | T-2451-1 | Alluminum seals for PCR plate storage https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2451-1 |
Polyolefin Sealing Film for PCR Plates | GeneMate | T-2450-1 | Plastic seals for PCR plates during cycling https://www.bioexpress.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=T-2450-1 |
PCR Cooler | Eppendorf | 22510525 | 96-well cold block https://online-shop.eppendorf.us/US-en/Temperature-Control-and-Mixing-44518/Accessories-44520/PCR-Cooler-PF-55940.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
GenCatch Plasmid DNA Mini-Prep Kit | Epoch Life Sciences | 2160250 | Plasmid DNA purification kit http://www.epochlifescience.com/Product/PurificationKit/dna_mini.aspx |
T4 DNA Ligase (HC) | Promega | M1794 | High concentration T4 DNA Ligase https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/molecular-biology-enzymes-and-reagents/t4-dna-ligase/?catNum=M1794 |
BbsI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0539L | BbsI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r0539-bbsi |
BsaI Restriction Enzyme | New England Biolabs | R0535L | BsaI enzyme at 10,000 units/ml https://www.neb.com/products/r3535-bsai-hf |
T4 DNA Ligase Buffer Pack | Promega | C1263 | 10x T4 DNA ligase buffer https://www.promega.com/products/cloning-and-dna-markers/cloning-tools-and-competent-cells/t4-dna-ligase/ |
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Zymo Research | I1001-25 | 0.5M IPTG Solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/isopropyl-ss-d-thiogalactopyranoside-iptg |
5-bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-galactopyranoside (X-GAL) | Zymo Research | X1001-25 | 20 mg/ml X-GAL solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/chemicals/5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ss-d-galactopyranoside-x-gal |
Kanamycin Sulfate | Zymo Research | A1003-25 | 35 mg/ml Kanamycin solution http://www.zymoresearch.com/buffers-solutions/antibiotics/kanamycin-sulfate |
Carbenicillin (Disodium Salt) | Fisher | BP26481 | 1 g Carbenicillin (Ampicillin analog) https://www.fishersci.com/shop/products/carbenicillin-disodium-salt-fisher-bioreagents-3/p-25005#?keyword=carbenicillin |
SOC Broth Media | Teknova | S0225 | Powder media used to make SOC broth http://www.teknova.com/SOC-BROTH-MEDIA-p/s0225.htm |
LB Broth (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L3022-1KG | Powder media used to make LB broth http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l3022?lang=en®ion=US |
LB Broth with agar (Lennox) Media | Sigma-Aldrich | L2897-1KG | LB with agar mix used for making solid media plates http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l2897?lang=en®ion=US |
Alpha-Select Gold Efficiency Competent Cells | Bioline | BIO-85027 | High efficiency chemically competent E. coli cells http://www.bioline.com/us/alpha-select-gold-efficiency.html |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers | |||
Primer VF | 5'-TGCCACCTGACGTCTAAGAA-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |
||
Primer VR | 5'-ATTACCGCCTTTGAGTGAGC-3' Primers used for Sanger sequencing and colony PCRs |