Hier berichten wir eine schnelle und effiziente Gen Editierverfahren basierend auf RMCE im AAVS1 Locus der menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs), die auf die zuvor beschriebenen Systeme verbessert. Mit dieser Technik können isogene Linien schnell und zuverlässig für die richtige Vergleichsstudien erzeugt, erleichtert Transgenität vermittelte Forschung mit hPSCs.
Auch bei der Revolution von Gen-Targeting – Technologien geführt von CRISPR-Cas9, der genetischen Veränderung von menschlichen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) ist immer noch zeitaufwendig. Vergleichende Studien, die rekombinante Linien mit Transgene integriert in den sicheren Hafen loci nutzen könnten von Ansätzen profitieren, die ortsspezifische gezielte Rekombinasen verwenden, wie Cre oder FLPe, die schneller sind und weniger anfällig für Off-Target-Effekte. Derartige Verfahren sind beschrieben worden, obwohl sie in den meisten Aspekten Targeting nicht wesentlich übertreffen Gen tun. Mit Zink-Finger – Nukleasen, wir zuvor erstellt eine Master – Zelllinie in AAVS1 Locus von hPSCs , die ein GFP-Hygromycin-tk enthält Kassette exprimieren, flankiert von heterotypic FRT – Sequenzen. Hier beschreiben wir die Verfahren FLPe Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) mit dieser Linie durchzuführen. Der Master-cell Leitung ist mit einem RMCE Donor-Vektor transfiziert, der ein promotor Puromycin-Resistenz enthält und mit FLPe Rekombinase. Die Anwendung sowohl eine positive (Puromycin) und negativen (FIAU) Auswahlprogramm führt zur Auswahl von RMCE ohne Zufallsintegrationen. RMCE erzeugt vollständig charakterisiert pluripotenten polyklonalen transgenen Linien in 15 d mit 100% Wirkungsgrad. Trotz der kürzlich Einschränkungen des AAVS1 Locus beschrieben, ebnet die Leichtigkeit des Systems den Weg für HPSC Transgene in isogenen Einstellungen ist, die für vergleichende Studien und ermöglicht semi-Hochdurchsatz – genetischen Screens für Gewinn / Verlust der Funktionsanalyse, die sonst als sehr zeitaufwendig.
Gezielte Genom Rekombination hat in vielen Bereichen der Forschung rasche Fortschritte erleichtert. Bei Mäusen hat sich für ein besseres Verständnis des komplexen Mechanismus der Genfunktion und Genregulation erlaubt die Synergie zwischen Genom-Bearbeitung und Stammzellforschung. Dieser Fortschritt ist in der humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) als auch zu erwarten, obwohl seit vielen Jahren seit der ersten Isolierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen), und später menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), Gen-Bearbeitung eine technische Hürde gebildet hat . Jüngste Fortschritte in der Genomtechnik durch gezielte Nukleasen-Zink-Finger-Nukleasen (ZFNs), Transkriptionsaktivator- artigen Effektor Nukleasen (TALEN) oder Clustered regelmäßig voneinander beabstandete kurze Palindrom Wiederholungen / CRISPR-assoziierten Protein 9 (CRISPR / Cas9) haben uns erlaubt, diese zu überwinden 3 – Schwierigkeiten, Rekombination , ein effizientes Verfahren 1 gezielt zu machen.
Spezifische Loci in der mouse Genom, mit denen stabile, zuverlässige und allgegenwärtige Transgen – Expression in Abwesenheit von Nebenwirkungen wie Rosa26, HPRT1 oder Col1A1 haben wesentlich geworden Werkzeuge bei der Durchführung von genetischen Untersuchungen. Sicherer Hafen loci ermöglichen vergleichbare Analyse zwischen verschiedenen Linien von Mäusen in isogenen Kontexten. Das kann nicht mit Standard-Zufallsintegrationsverfahren erreicht, die mit den bekannten Einschränkungen wie Insertionsmutagenese, dosisabhängige Effekte, oder bunten Transgen-Expression assoziiert sind. Gene Bearbeitung einfach und flexibel in sicheren Hafen loci wird durch die Verwendung von ortsspezifische gezielte Rekombinasen wie Cre oder Flippase (FLPe) erhöht, die spezifisch Zielsequenzen (loxP oder FRT, jeweils) zu erkennen und effiziente Rekombination zwischen identischen Zielen katalysieren. Aufgrund dieser Eigenschaften ist Rekombinase-vermittelte Gen Bearbeitung mit loxP oder FRT-Sequenzen in vorintegrierten sicheren Hafen Loci ein übliches Werkzeug in der Maus verwendet transGenesis. Zusätzlich zur Kassetteneinschub- oder zwischen identischen Zielsequenzen vermittelte Exzision gestattet die Verwendung von inkompatiblen loxP oder FRT – Stellen für die Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) 4.
In der menschlichen Versuche, sicheren Hafen Loci durchgeführt wurden zu identifizieren. Die Maus orthologous HPRT trotz seiner Verbindung mit dem Verlust der Funktion Lesch-Nyhan – Syndrom und ROSA26 haben in hPSCs gezielt worden. HPRT schnell Transgen – Expression berichtet wurde ESC zum Schweigen zu bringen und, wie ROSA26, seine Fähigkeit , die Transgen – Expression zu erhalten in 7 – terminal differenzierten Zellen wurde nicht 5 untersucht. Da eine homozygote Nullmutation des CCR5 – Gens beim Menschen gut verträglich zu sein scheint, wurde sein Wert als sicheren Hafen beurteilt. CCR5 wurde gezielt und berichtet stabile Transgen – Expression in verschiedenen menschlichen Zelllinien zu erhalten, einschließlich der WSR 8,9. Aber,letzterer wurde nicht auf der klonalen Ebene während einer Langzeitkultur erwiesen und ubiquitäre Transgen – Expression wurde nicht in differenzierte Nachkommen der drei Keimschichten. AAVS1, die natürliche Integrationsstelle des Adeno Associated Virus Typ 2 (AAV), wurde gezeigt , getestet in hESCs als auch, aufgrund von Berichten über Widerstand gegen Transgen – Silencing 10. Später viele Gruppen verwendet , um die AAVS1 Locus und beschrieben stabile transgene Expression in undifferenzierten hPSCs sowie in ihren differenzierten Nachkommen aller drei Keimschichten, sowohl in vitro als auch in vivo 2,8,11,12. Die jüngsten Ergebnisse Nuance dennoch diese Ergebnisse, da der AAVS1 Locus gefunden wurde in vitro in undifferenzierten hES und in Hepatozyten Nachkommen 13 variable Transgen Hemmung auszuüben.
Weitere Screening-Studien zufällige Integration Ansätze und Methoden unter Verwendung von Einzelkopie-Integration zu bestimmen, richtet geno zu findenmic Integrationsstellen resistent gegen Transgen – Silencing bei hPSCs Expansion und Differenzierung 14,15. Insgesamt bisher wurde kein Genomstelle vollständig als sicherer Hafen in hPSCs und ihre Nachkommen validiert; Identifizierung einer geeigneten Stelle für die ubiquitäre stabilen Transgen – Expression, nicht nur in hPSCs sondern auch in ihren differenzierten Nachkommen in vitro und in vivo bleibt, gelöst werden. Unter allen untersuchten Loci und trotz ihrer Grenzen bleibt AAVS1 die am besten charakterisierte und am häufigsten verwendeten in der Stammzellenforschung.
RMCE wurde in hPSCs in einigen dieser Loci 6,7,14,16 unter Verwendung meist Cre – Rekombinase erfolgreich durchgeführt, auch wenn es Anzeichen dafür gibt , dass FLPe effizienter als Cre 17 ist. In all diesen Fällen wird eine positive Arzneimittelresistenzkassette wurde für die Selektion von rekombinanten Kolonien verwendet. Obwohl erfolgreich, sie bilden diese Verfahren keinen technischen Fortschritt gegenüber Standard-Gen-Bearbeitungsverfahren ZFNs, Talens oder CRISPR / Cas9, als ein einziges Antibiotikum Auswahlverfahren schließt nicht aus, zufällige Integrationen und erfordert Kolonie-Screening korrekt zu identifizieren, gezielt Klone verwenden.
In diesem Verfahren beschreiben wir Verfahren RMCE in hPSCs in der AAVS1 Locus unter Verwendung einer Kombination von positiv (innerhalb der ankommenden Kassette) und negativen (innerhalb der vorintegrierten Kassette) Selektionen durchzuführen , die für die Erzeugung von polyklonalen transgenen Linien in ± 15 Tage ermöglichen , mit 100% Effizienz und frei von zufälligen Integration Veranstaltungen. Daher stellt diese Methode Fortschritt gegenüber gegenwärtig beschriebenen RMCE Technologien in hPSCs.
Gene Bearbeitungsmethoden in sicheren Hafen loci bleiben ein wichtiges Instrument Transgene in hPSCs zu entwickeln. Obwohl der sichere Hafen Charakter AAVS1 hat vor kurzem für einige Anwendungen 13,18 in Frage gestellt wurde, bleibt diese Stelle derzeit in Menschen stamm gekennzeichnet beste Zelllinien. Das Bewusstsein für ihre Grenzen in hPSCs kann helfen, zuverlässige Daten zu erhalten. Daher wird AAVS1 noch eine nützliche Website zu erwarten sind , beispielsweise für die Verstärkungs- und loss-of-function – Studien oder induzierbare / konstitutive Expression von Faktoren , die eine isogene Kontext innerhalb und zwischen bestimmten genetischen Hintergründen erforderlich.
Die AAVS1 Locus wurde von vielen Gruppen ins Visier genommen ZFNs, TALEN oder CRISPR / Cas9 1,2,19 verwenden. Diese Nukleasen erhöhen signifikant die Effizienz der homologen Rekombination in einem bestimmten Ort. Doch in den Prozessbildschirm und vollständig zu charakterisieren richtig gezielt Klone, frei von zufälligen integRation und Pluripotenz und Genomintegrität aufrecht zu erhalten bis zu 3 Monate in Anspruch nehmen (Abbildung 3) (optimierte Gen – Editing – Tools verwenden). Die letzten beiden können durch mögliche Mutationen durch Off-Target-Nukleaseaktivität erzeugt verursacht werden. Das RMCE System hier verwendet, jedoch bietet eine schnelle, effiziente und elegante Methode , um dieses Ziel in nur zwei Wochen erreichen, sobald Rekombinase-spezifischen Zielsequenzen in den AAVS1 Locus vorintegrierten werden. Verwendung von positiven / negativen Selektion und einem geeigneten Selektionsprogramm sind die wichtigsten Faktoren für die Vereinfachung der Gen Bearbeitung im AAVS1 Locus durch RMCE beiträgt.
Genotypischen Charakterisierung der neuen transgenen Linien signifikant reduziert (ohne klonale Screening notwendig ist), und die Charakterisierung verbundenen Off-Target-Nuclease-Aktivität entbehrlich aufgrund der Spezifität der FLPe für FRT gemacht. Die Charakterisierung kann auch in der Routine RMCE Experimente reduziert werden, indem der Nachweisvollständigen Verlust der GFP – Expression von der Master – Zelllinie (2A), da volle Kassettenaustausch und der Mangel an zufälligen Integration bereits ausreichend nachgewiesen durch PCR (2B) und Southern – Blot – 13 ist. Die Verwendung von positiven / negativen Selektion stellt auch die größte Unterschied zu früheren Berichten. Mehrere Gruppen , die in hPSCs zuvor RMCE beschrieben, entweder in der AAVS1 oder andere Loci, nur eine einzige positive Selektionsschritt 7,14,16 eingesetzt. Dies stellt keine großen technischen Vorteil gegenüber Gen-Bearbeitung mit Nukleasen ausgeführt darstellen, weil Kolonie-Screening ebenso durchgeführt, um muss korrekte Integration und das Fehlen von zufälligen Integration auf der klonalen Ebene zu demonstrieren.
Die Nutzung dieser RMCE System in mehreren hESC / iPSC Linien erfordert preintegration der beschriebenen FRT enthaltenden Kassette im AAVS1 Locus jeder unabhängigen Linie. Wenn jedoch einmal erzeugt,seine Schnelligkeit und Einfachheit macht es möglich, halb hohen Durchsatz genetischen Screens in definierten isogenen Einstellungen für Anwendungen zu entwickeln, sonst technisch sehr zeitaufwendig wäre darüber erwähnt werden. Darüber hinaus sind alle RMCE Vektoren innerhalb des pZ AAVS1 Gen-Targeting – Vektor konstruiert , verwendet , um den Locus mit ZFNs Ziel, aber TALENS oder CRISPR / Cas9 wurden ebenfalls berichtet. Die Dualität der RMCE Vektor ist sehr nützlich mehrere Zeilen für einen bestimmten Transgen in hPSCs mit oder ohne FRT zu erzeugen. Beispielsweise in einer bestimmten genetischen Screen durchgeführt, indem RMCE müssten idealerweise getestet werden, in mehreren Linien HPSC einen Treffer erfolgreich demonstriert, um die Ergebnisse zu bestätigen. In Abwesenheit von mehreren RMCE-geeigneten Master-Zelllinien, direkte Gen des Treffers Targeting Nukleasen mit durchgeführt werden konnte. Der Nutzen des dualen Charakter der RMCE Vektoren wurde von unserer Gruppe 20 belegt. In dieser Studie wurde Genkorrektur durchgeführt in Patienten stammFrontotemporale Demenz (FTD) iPSCs , die eine Mutation verursacht progranulin (PGRN) Ausdruck Mangel tragen. Gene Komplementation durch ZFNs vermittelte Insertion in den Locus AAVS1 einer Kassette , die PGRN Pegel wiederhergestellt, korrigiert , um die defekten Phänotyp in Kortikogenese mit dem Vorhandensein der Mutation in Verbindung gebracht. Zusätzlich wurde eine vergleichbare Linie von RMCE in WT hESCs erzeugt für exogene PGRN Ausdruck als Kontrolle verwendet werden.
In Abwesenheit von rekombinanten Kolonien, überprüfen Transfektionseffizienz des RMCE Donorvektor. Transfektionseffizienzen überlegen zu 30% ergeben sich die oben angegebenen Ergebnisse. Niedrigere Transfektionseffizienzen verringern Rekombination Effizienz. Schließlich hat die RMCE System im AAVS1 Locus erzeugt worden ist , aber es ist anwendbar auf jeden anderen Locus.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |