Aquí se presenta un método de edición gen rápida y eficiente basado en RMCE en el locus de AAVS1 humanas pluripotentes células madre (hPSCs) que mejora los sistemas anteriormente descritos. Usando esta técnica, líneas isogénicas se pueden generar rápida y fiable para los estudios comparativos adecuados, facilitar la investigación transgénesis mediada con hPSCs.
Incluso con la revolución de las tecnologías de reconocimiento de genes dirigidos por CRISPR-Cas9, la modificación genética de las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) sigue siendo lento. Los estudios comparativos que utilizan líneas recombinantes con transgenes integrados en loci puerto seguro, podrá beneficiarse de los enfoques que utilizan recombinasas específicas de sitio específico, como Cre o FLPe, que son más rápidos y menos propensos a los efectos desviado. Se han descrito Tales métodos, aunque no lo hacen significativamente gen superan la orientación en la mayoría de los aspectos. El uso de nucleasas de dedos de zinc, que previamente creó una línea de células maestras en el locus de AAVS1 hPSCs que contiene una GFP-higromicina-tk que expresa casete, flanqueado por secuencias FRT heterotípicos. A continuación, se describen los procedimientos para llevar a cabo el intercambio de casete FLPe recombinasa mediada (RMCE) usando esta línea. El maestro clínea ell se transfecta con un vector donante RMCE, que contiene un promotor de resistencia a puromicina, y con FLPe recombinasa. Aplicación del programa de selección tanto positiva (puromicina) y negativo (UIAF) conduce a la selección de RMCE sin integraciones aleatorias. RMCE genera líneas transgénicas policlonales pluripotentes caracterizado completamente en el 15 d con una eficiencia del 100%. A pesar de la recientemente descrita limitaciones del locus AAVS1, la facilidad del sistema allana el camino para HPSC transgénesis en los entornos isogénicas, es necesario para los estudios comparativos, y permite a las pantallas de genética semi-alto rendimiento para la ganancia / pérdida de análisis de funciones que de otro modo ser altamente tiempo.
Targeted recombinación del genoma ha facilitado los rápidos avances en muchas áreas de la investigación. En ratones, la sinergia entre la edición del genoma y la investigación con células madre ha permitido una mayor comprensión del complejo mecanismo de la función de genes y la regulación de genes. Se espera que tales avances en las células humanas pluripotentes madre (hPSCs), así, a pesar de que desde hace muchos años desde que el primer aislamiento de células madre embrionarias humanas (hESCs), y más tarde humana células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), edición gen ha constituido un obstáculo técnico . Los recientes avances en la ingeniería del genoma utilizando nucleasas-cinc dirigidos Finger nucleasas (ZFNs), la transcripción nucleasas efectoras del tipo activador de (TALEN), o en clúster intercaladas con regularidad corto repeticiones palindrómicas / proteína CRISPR-asociado 9 (CRISPR / Cas9) nos han permitido superar estas dificultades, la toma de recombinación dirigida un proceso eficiente de 1 – 3.
loci específicos en el mouse genoma que permiten la expresión transgénica estable, fiable y ubicuo en la ausencia de efectos adversos como Rosa26, HPRT1, o Col1A1, se han convertido en herramientas esenciales en la realización de estudios genéticos. loci de salvaguarda permiten el análisis comparables entre diferentes líneas de ratones en contextos isogénicas. Esto no se puede lograr usando métodos de integración aleatoria estándar, que se asocian con limitaciones bien conocidas como la mutagénesis de inserción, los efectos dependientes de la dosis, o la expresión del transgen abigarrada. Gen de facilitar la edición y la flexibilidad en los loci puerto seguro se incrementa mediante el uso de recombinasas específicas de sitio específico como Cre o flipasa (FLPe), que reconocen específicamente secuencias diana (loxP o FRT, respectivamente) y catalizan la recombinación eficiente entre los objetivos idénticos. Debido a estas características, la edición gen de la recombinasa mediada por el uso de secuencias loxP o FRT en preintegradas loci puerto seguro es una herramienta común utilizada en el ratón transgénesis. Además de la inserción de casete o escisión mediada entre secuencias diana idénticas, el uso de sitios loxP o FRT incompatibles permite el intercambio de casete recombinasa mediada (RMCE) 4.
En humanos, los intentos de identificar loci de puerto seguro han llevado a cabo. La HPRT ortólogos de ratón, a pesar de su asociación con el síndrome de Lesch-Nyhan pérdida de función, y ROSA26 han sido blanco de hPSCs. HPRT se informó de silenciar rápidamente la expresión del transgen en el CES y, al igual ROSA26, su capacidad para sostener la expresión del transgen en terminales células diferenciadas no se investigó 5-7. Debido a una mutación nula homocigótica del gen de CCR5 parece ser bien tolerada en los seres humanos, se evaluó su valor como puerto seguro. CCR5 era específico y informó para sostener la expresión transgénica estable en diferentes líneas celulares humanas, incluyendo CES 8,9. Sin embargo,este último no se ha demostrado a nivel clonal durante el cultivo a largo plazo, y la expresión del transgen en todas partes, no se demostró en progenie diferenciada de las tres capas germinales. AAVS1, el sitio de integración natural de la Adeno Asociadas tipo Virus 2 (AAV), se puso a prueba en hESCs así, debido a la resistencia informado a silenciar transgén 10. Más tarde, muchos grupos utilizaron el locus AAVS1 y describen la expresión transgénica estable en hPSCs no diferenciadas, así como en su progenie diferenciada de las tres capas germinales, tanto in vitro como in vivo 2,8,11,12. Los resultados recientes, sin embargo, estos hallazgos matiz, ya que se encontró el locus AAVS1 para ejercer la inhibición variable de transgenes in vitro en hESCs indiferenciada y en la progenie de hepatocitos 13.
Los estudios de investigación adicionales utilizando enfoques de integración al azar y los métodos para determinar la integración de copia única destinada para encontrar genositios de integración de micro resistentes al silenciamiento de transgenes durante la expansión y diferenciación hPSCs 14,15. En general, hasta ahora, ningún sitio genómico ha sido completamente validado como un puerto seguro en hPSCs y su progenie; la identificación de un sitio apropiado para la expresión transgénica estable en todas partes, no sólo en hPSCs sino también en sus progenies diferenciadas in vitro e in vivo, queda por resolver. Entre todos los loci estudiados ya pesar de sus limitaciones, AAVS1 sigue siendo la mejor caracterizada y más utilizada en la investigación de células madre.
RMCE se ha realizado con éxito en hPSCs en algunos de estos loci 6,7,14,16, utilizando la mayoría de la recombinasa Cre, aunque hay indicios de que FLPe es más eficiente que Cre 17. En todos estos casos, se usó un casete de resistencia a los medicamentos positivo para la selección de las colonias recombinantes. Aunque tuvo éxito, estos procedimientos no constituyen un avance técnico más gene- normaprocedimientos de edición utilizando ZFNs, Talens o CRISPR / Cas9, como un único procedimiento de selección de antibióticos no descarta integraciones aleatorias y requiere la detección de colonias para identificar clones correctamente orientados.
En este procedimiento, se describen los métodos para llevar a cabo RMCE en hPSCs en el locus AAVS1 usando una combinación de positivo (dentro de la casete de entrada) y negativo (dentro de la casete preintegradas) selecciones que permitan la generación de líneas transgénicas policlonales en ± 15 días con una eficiencia del 100% y libre de eventos de integración al azar. Por lo tanto, este método representa un avance más allá de las tecnologías actualmente RMCE descritos en hPSCs.
métodos de edición de genes en loci de puerto seguro siguen siendo una herramienta esencial para el desarrollo de la transgénesis en hPSCs. Aunque el carácter de puerto seguro de AAVS1 recientemente ha sido cuestionada por algunas aplicaciones 13,18, este lugar sigue siendo actualmente el mejor caracterizado en líneas celulares derivadas de seres humanos. La conciencia de sus limitaciones en hPSCs puede ayudar a obtener datos fiables. Por lo tanto, AAVS1 todavía se espera que sea un sitio útil, por ejemplo, para estudios de ganancia y la pérdida de función o expresión inducible / constitutiva de factores que requieren un contexto isogénica dentro y entre los fondos genéticos determinados.
El locus AAVS1 ha sido el objetivo de muchos grupos que utilizan ZFNs, TALEN o CRISPR / Cas9 1,2,19. Estas nucleasas aumentan significativamente la eficacia de la recombinación homóloga en un locus determinado. Sin embargo, el proceso para seleccionar y caracterizar completamente clones correctamente orientados, de forma aleatoria integración y para mantener la pluripotencia y la integridad del genoma puede tardar hasta 3 meses (utilizando herramientas de edición de genes optimizados) (Figura 3). Los dos últimos pueden ser causados por posibles mutaciones generadas por la actividad nucleasa desviado. El sistema RMCE utilizado aquí, sin embargo, ofrece un método rápido, eficiente y elegante para lograr este objetivo en sólo dos semanas, una vez que las secuencias diana-recombinasa específica se preintegradas en el locus AAVS1. El uso de la selección positiva / negativa y un programa de selección apropiada son los principales factores que contribuyen a la simplificación de la edición de genes en el locus AAVS1 por RMCE.
caracterización genotípica de las nuevas líneas transgénicas se reduce de manera significativa (sin detección clonal es necesario), y la caracterización asociada a la actividad nucleasa fuera del objetivo se hace prescindible debido a la especificidad de FLPe para frs. La caracterización también se puede reducir en los experimentos de rutina RMCE demostrando lapérdida completa de la expresión de GFP desde la línea de células maestras (Figura 2A), ya que el intercambio de casete completa y la falta de integración aleatoria ya han sido suficientemente demostrado por PCR (Figura 2B) y Southern blot 13. El uso de la selección positiva / negativa también constituye la principal diferencia con los informes anteriores. Varios grupos que anteriormente descritos RMCE en hPSCs, ya sea en el AAVS1 o otros loci, emplean sólo una única etapa de selección positiva 7,14,16. Esto no constituye una ventaja técnica importante sobre la edición gen realizado con nucleasas, porque la detección de colonias tiene que ser realizado igualmente con el fin de demostrar la integración y la ausencia de integración aleatoria correcta a nivel clonal.
El uso de este sistema de RMCE en múltiples líneas / IPSC de células madre requiere pre-integración del casete descrito contiene FRT en el locus AAVS1 de cada línea independiente. Sin embargo, una vez generado,su rapidez y simplicidad hace que sea posible el desarrollo de las pantallas de genética semi-alto rendimiento en los entornos isogénicas definidas para las aplicaciones mencionadas anteriormente que de otro modo sería técnicamente mucho tiempo. Además, todos los vectores RMCE se construyen dentro del vector gen de la orientación pZ AAVS1 utilizado para dirigir el locus con ZFNs, pero también se informó de Talens o CRISPR / Cas9. dualidad del vector RMCE es altamente útil para generar varias líneas para un transgén determinado en hPSCs con o sin FRT. Por ejemplo, un hit demostró con éxito en una pantalla genética determinada llevada a cabo por RMCE lo ideal sería que tenga que ser probado en múltiples líneas HPSC para confirmar los resultados. En ausencia de varias líneas de células primarios RMCE-adecuado, gen objetivo directo de la exitosa usando las nucleasas se pudo realizar. La utilidad del carácter dual de los vectores RMCE ha sido probado por nuestro grupo 20. En este estudio, la corrección de genes se realizó en derivados de pacienteLa demencia frontotemporal (DFT) iPSCs que llevan una mutación que causa progranulin (PGRN) deficiencia de expresión. Gen de complementación mediante la inserción ZFNs mediada en el locus AAVS1 de un casete que restauró los niveles de PGRN, corrigió el fenotipo defectuoso en corticogenesis asociado con la presencia de la mutación. Además, una línea comparable fue generada por RMCE en hESCs WT para ser utilizado como control para la expresión PGRN exógeno.
En ausencia de colonias recombinantes, comprobar la eficacia de transfección del vector donante RMCE. Las eficacias de transfección superiores a 30% de rendimiento los resultados indicados anteriormente. Una menor eficiencia de transfección disminuyen la eficiencia de recombinación. Finalmente, el sistema RMCE se ha generado en el locus AAVS1, pero es aplicable a cualquier otro locus.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |