Her rapporterer vi en hurtig og effektiv gen redigering metode baseret på RMCE i AAVS1 locus af humane pluripotente stamceller (hPSCs), der forbedrer tidligere beskrevne systemer. Ved hjælp af denne teknik, kan isogene linjer hurtigt og pålideligt genereret for ordentlig sammenlignende undersøgelser, lette transgenese-medieret forskning med hPSCs.
Selv med revolutionen af gen-targeting teknologier ledet af CRISPR-Cas9, genetisk modifikation af menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) stadig tidskrævende. Sammenlignende undersøgelser, der bruger rekombinante linjer med transgener integreret i sikker havn loci kunne drage fordel af tilgange, der bruger stedspecifikke målrettede rekombinaser, ligesom Cre eller FLPe, som er hurtigere og mindre tilbøjelige til off-target effekter. Sådanne fremgangsmåder er blevet beskrevet, selv om de ikke i betydelig udkonkurrerer genmålretning i de fleste aspekter. Brug Zink-finger nukleaser, vi tidligere har oprettet en mester cellelinje i AAVS1 locus af hPSCs der indeholder et GFP-Hygromycin-tk udtrykker kassette, flankeret af heterotypiske FRT-sekvenser. Her beskriver vi de procedurer, til at udføre FLPe rekombinase-medieret kassette udveksling (RMCE) ved hjælp af denne linje. Føreren cell line transficeres med en RMCE donorvektor, som indeholder et promotorløst puromycinresistens, og med FLPe rekombinase. Anvendelse af både en positiv (Puromycin) og negative (FIAU) programvalg fører til udvælgelsen af RMCE uden tilfældige integrationer. RMCE genererer fuldt karakteriserede pluripotente polyklonale transgene linier i 15 d med 100% effektivitet. På trods af den nyligt beskrevne begrænsninger AAVS1 locus, den lethed af systemet baner vej for hPSC transgenese i isogene indstillinger, er nødvendig for sammenlignende undersøgelser, og muliggør semi-high-throughput genetiske skærme for gevinst / tab af funktion analyse, der ellers ville være meget tidskrævende.
Målrettet genom rekombination har lettet hurtige fremskridt på mange forskningsområder. Hos mus har synergien mellem genom redigering og stamcelleforskning tilladt for en øget forståelse af den komplekse mekanisme af genfunktioner og genregulering. forventes Sådanne fremskridt i humane pluripotente stamceller (hPSCs) samt, om end i mange år, siden den første isolation af humane embryonale stamceller (hESCs), og senere menneske induceret pluripotente stamceller (hiPSCs), gen redigering har udgjort en teknisk forhindring . Nylige fremskridt i genom engineering ved hjælp af målrettede nucleaser-Zink Finger nukleaser (ZFNs), transskription aktivator-lignende effektor nukleaser (Talen) eller Grupperet regelmæssigt indbyrdes afstand kort palindrome gentagelser / CRISPR-associeret protein 9 (CRISPR / Cas9) har tilladt os at overvinde disse vanskeligheder, arbejder målrettet rekombination en effektiv proces 1 – 3 ud.
Specifikke loci i mOuse genom, der tillader stabil, pålidelig og allestedsnærværende transgen ekspression i fravær af skadelige effekter som Rosa26, Hprt1 eller COL1A1, er blevet vigtige redskaber i udførelsen af genetiske undersøgelser. Safe harbor loci tillader sammenlignelig analyse mellem forskellige linjer af mus i isogene sammenhænge. Dette kan ikke opnås ved anvendelse af standard vilkårlig integration fremgangsmåder, der er forbundet med kendte begrænsninger som insertionsmutagenese, dosisafhængige virkninger, eller brogede transgenekspression. Gene redigering lethed og fleksibilitet i sikker havn loci øges gennem anvendelse af stedspecifikke målrettede rekombinaser som Cre eller Flippase (FLPe), som specifikt genkender målsekvenser (loxP eller FRT henholdsvis) og katalyserer effektiv rekombination mellem identiske mål. På grund af disse egenskaber, rekombinase-medieret gen redigering under anvendelse loxP eller FRT-sekvenser i preintegrated sikker havn loci er et fælles værktøj, der anvendes i mus transtilblivelse. Foruden kassette insertion eller udskillelse medieret mellem identiske målsekvenser, anvendelse af inkompatible loxP eller FRT-steder muliggør rekombinase-medieret kassette udveksling (RMCE) 4.
Hos mennesker forsøger at identificere safe harbor loci er blevet udført. Musen ortologe HPRT, på trods af sin tilknytning til tab af funktion lesch-nyhans syndrom, og ROSA26 har været målet i hPSCs. HPRT blev rapporteret til hurtigt at lukke munden på transgen ekspression i ESC og ligesom ROSA26, dens evne til at opretholde transgen ekspression i terminalt differentierede celler blev ikke undersøgt 5-7. Fordi en homozygot nul mutation af CCR5 genet synes at være veltolereret i mennesker, blev dens værdi som sikker havn vurderes. CCR5 var målrettet og rapporteres at opretholde stabil transgen ekspression i forskellige humane cellelinjer, herunder økonomiske og sociale råd 8,9. Imidlertid,denne blev ikke påvist på den klonale niveau under langvarig kultur, og allestedsnærværende transgenekspression blev ikke påvist i differentierede afkom af de tre kimlag. AAVS1, den naturlige integration site af adenoassocieret virus type 2 (AAV), blev testet i hESCs samt, på grund af rapporterede modstand mod transgen lyddæmpning 10. Senere, mange grupper brugte AAVS1 locus og beskrevet stabil transgenekspression i udifferentierede hPSCs, såvel som i deres differentierede afkom af alle tre kimlag, både in vitro og in vivo 2,8,11,12. De seneste resultater alligevel nuancere disse resultater, da AAVS1 locus viste sig at udøve variabel transgen hæmning in vitro i udifferentierede hESCs og hepatocyt afkom 13.
Yderligere screening studier med anvendelse af tilfældige integration tilgange og metoder til at bestemme enkelt kopi integration til formål at finde genomic integrationssteder resistente over for transgen silencing under hPSCs ekspansion og differentiering 14,15. Samlet set indtil nu, ingen genomisk websted er blevet fuldt valideret som en sikker havn i hPSCs og deres afkom; identifikation af et passende sted til ubiquitous stabil transgenekspression, ikke kun i hPSCs men også i deres differentierede afkom in vitro og in vivo, er endnu ikke løst. Blandt alle de undersøgte loci og på trods af sine begrænsninger, forbliver AAVS1 den bedst karakteriseret og mest anvendte i stamcelleforskning.
RMCE er blevet udført i hPSCs i nogle af disse loci 6,7,14,16, hjælp meste Cre rekombinase, selv om der er tegn på, at FLPe er mere effektiv end Cre 17. I alle disse tilfælde blev en positiv lægemiddel-resistente kassette anvendes til valg af rekombinante kolonier. Selvom det lykkes, har disse procedurer ikke udgør et teknisk fremskridt i forhold til standard gene-redigering procedurer ved hjælp ZFNs, Talens eller CRISPR / Cas9, som en enkelt udvælgelsesprocedure antibiotikum udelukker ikke tilfældige integrationer og kræver koloni screening for at identificere korrekt målrettede kloner.
I denne procedure, vi beskriver fremgangsmåder til at udføre RMCE i hPSCs i AAVS1 locus ved anvendelse af en kombination af positiv (inden for den indkommende kassette) og negative (i det preintegrated kassette) markeringer, der muliggør frembringelsen af polyklonale transgene linjer i ± 15 dage sammen med 100% effektivitet og fri for tilfældige integration begivenheder. Derfor er denne metode repræsenterer fremskridt ud over aktuelt beskrevne RMCE teknologier i hPSCs.
Gene redigering metoder i safe harbor loci fortsat et vigtigt redskab til at udvikle transgenese i hPSCs. Selv safe harbor karakter AAVS1 nylig er blevet afhørt for nogle applikationer 13,18, i øjeblikket forbliver dette locus bedst kendetegnet ved human-afledte cellelinjer. Bevidsthed om sine begrænsninger i hPSCs kan hjælpe med at få pålidelige data. Derfor forventes fortsat AAVS1 at være et nyttigt websted, for eksempel til GAIN- og tab-of-funktion studier eller inducerbare / konstitutiv ekspression af faktorer, der kræver en isogen sammenhæng inden for og mellem bestemte genetiske baggrunde.
Den AAVS1 locus er blevet ramt af mange grupper bruger ZFNs, talen eller CRISPR / Cas9 1,2,19. Disse nukleaser øge effektiviteten af homolog rekombination i en bestemt locus. Men for at processen screene og fuldt ud at karakterisere korrekt målrettede kloner, fri for tilfældige integration og til at opretholde pluripotens og genome integritet kan tage op til 3 måneder (ved hjælp af optimerede gen redigeringsværktøjer) (Figur 3). De sidste to kan være forårsaget af mulige mutationer genereret af off-target nukleaseaktivitet. Det RMCE system, der anvendes her, men tilbyder en hurtig, effektiv og elegant metode til at opnå dette mål i kun to uger, når rekombinase-specifikke målsekvenser er preintegrated i AAVS1 locus. Anvendelse af positiv / negativ selektion og en passende programvalg er de vigtigste faktorer, der bidrager til en forenkling af gen redigering i AAVS1 locus af RMCE.
Genotypisk karakterisering af nye transgene linjer reduceres betydeligt (ingen klonal screening er nødvendig), og karakterisering forbundet til off-target nukleaseaktivitet gøres undværes på grund af den særlige FLPe for FRTS. Karakteriseringen kan også reduceres i rutinemæssige RMCE eksperimenter ved at demonstrerefuldstændig tab af GFP-ekspression fra master-cellelinie (figur 2A), fordi fuld kassette udveksling og mangel på vilkårlig integration er allerede blevet tilstrækkeligt påvist ved PCR (figur 2B) og Southern blot 13. Brugen af positiv / negativ selektion udgør også den største forskel med tidligere rapporter. Flere grupper, der tidligere beskrevne RMCE i hPSCs, enten i AAVS1 eller andre loci, anvendes kun et enkelt positivt selektionstrin 7,14,16. Dette udgør ikke en væsentlig teknisk fordel i forhold gen redigering udført med nukleaser, fordi koloni screening skal lige udført for at demonstrere korrekt integration og fravær af tilfældig integration på klonale niveau.
Brug af dette RMCE systemet i multiple hESC / IPSC linjer kræver preintegration af den beskrevne FRT-holdige kassette i AAVS1 locus i hver uafhængig linie. Men når der genereres,sin hurtighed og enkelhed gør det muligt at udvikle semi-high throughput genetiske skærme i definerede isogene indstillinger for programmer, der er nævnt ovenfor, der ellers ville være teknisk meget tidskrævende. Desuden er alle de RMCE vektorer konstrueres i pZ AAVS1 gen-targeting vektor, der anvendes til at målrette af stedet med ZFNs, men Talens eller CRISPR / Cas9 blev også rapporteret. Den RMCE vektoren dualitet er meget nyttigt at generere flere linjer til en bestemt transgen i hPSCs med eller uden FRT. For eksempel er en hit demonstreret succes i en bestemt genetisk skærm udført af RMCE ville ideelt set skal testes i flere hPSC linjer for at bekræfte resultaterne. I fravær af multiple RMCE-egnet mester cellelinier, kan direkte genmålretning af hit hjælp nukleaser udføres. Anvendeligheden af den dobbelte karakter af RMCE vektorer er blevet bevist af vores gruppe 20. I denne undersøgelse blev gen korrektion udført i patient-afledteFrontallapsdemens (FTD) iPSCs der bærer en mutation forårsager PROGRANULIN (PGRN) udtryk mangel. Gene komplementation af ZFNs-medieret indsættelse i AAVS1 locus i en kassette, restaureret PGRN niveauer, korrigeret det defekte fænotype i corticogenesis forbundet med tilstedeværelsen af mutationen. Desuden blev en sammenlignelig linje genereret af RMCE i WT hESCs til anvendelse som kontrol for exogen PGRN ekspression.
I mangel af rekombinante kolonier, kontrollere transfektionseffektiviteten af RMCE donorvektoren. Transfektionseffektiviteten overlegen til 30% udbytte resultaterne angivet ovenfor. Lavere transfektionseffektiviteten falde rekombinationseffektivitet. Endelig er RMCE systemet blevet genereret i AAVS1 locus, men det gælder for alle andre locus.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |