हम E15.5 करने के लिए पूरे भ्रूण murine दिलों में कोरोनरी वाहिकाओं के विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत, मानक प्रतिरक्षात्मक धुंधला ऑप्टिकल निकासी और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया तरीकों का उपयोग कर। इस तकनीक को धारावाहिक वर्गों के लिए समय लेने वाली विश्लेषण के लिए आवश्यकता के बिना पूरे दिल में रक्त वाहिकाओं के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है।
Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.
एक कार्य कोरोनरी नेटवर्क की स्थापना इस विकास की प्रक्रिया अंतर्निहित आणविक संकेतों में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते हैं दिल समारोह और भ्रूण विकास, और आनुवंशिक माउस म्यूटेंट के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। एक पूरे के रूप में भ्रूण कोरोनरी जाल कल्पना करने की क्षमता है, बल्कि histological वर्गों की एक श्रृंखला में प्रस्तुत की तुलना में, आनुवंशिक म्यूटेंट में पोत patterning के विश्लेषण की सुविधा के लिए आवश्यक है, और है कि यांत्रिक का एक परिणाम के रूप में हो सकता है जानकारी के संभावित नुकसान से बचा जाता है ऊतक के टुकड़ा करने की क्रिया। धमनियों के लिए फार्म नसीब वेसल्स और केशिकाओं दोनों निलय और महाधमनी 1-3 की दीवारों के भीतर गहरे स्थानीय कर रहे हैं। हालांकि, जबकि लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त wholemount लेबल सतही शिरापरक / लसीका वाहिकाओं 4,5 के उच्च संकल्प छवियों प्रदान कर सकते हैं कोशिकाओं के फ्लोरोसेंट लेबलिंग, इमेजिंग की गहराई ऑप्टिकल प्रवेश द्वारा सीमित है। टोपी के उच्च संकल्प इमेजिंगillaries और धमनियों दिल की पूरी गहराई भर इसलिए ऊतक समाशोधन के कुछ फार्म के बिना संभव नहीं है।
गरीब ऑप्टिकल पैठ कई सेलुलर और बाह्य (जैसे, कोलेजन और लोचदार फाइबर) मोटी ऊतकों के घटकों के उच्च अपवर्तनांक के कारण होता है। इस इमेजिंग प्रकाश scatters, धुंधला के कारण और इसके विपरीत कम किया है। क्लियरिंग एजेंट आमतौर पर इस तरह के ऊतकों के उच्च अपवर्तनांक मैच, जिसका अर्थ है कि प्रकाश नमूना अबाधित के माध्यम से यात्रा और ऊतकों में गहरी पैठ कर सकते हैं। साफ़ करने से पहले, ऊतकों आम तौर पर सूखे चूर्ण पानी के रूप में एक अपेक्षाकृत कम अपवर्तनांक हो गया है। नई समाशोधन ढेर सारे तरीकों के हाल ही में विकसित किया गया है, लेकिन इस्तेमाल किया, समाशोधन प्रक्रिया दिनों या हफ्तों ले जा सकते हैं और महंगा अभिकर्मकों 6-9 की आवश्यकता हो सकती तकनीक पर निर्भर करता है। BABB (एक 1: बेंजाइल अल्कोहल और लोबान बेंजोएट के 2 मिश्रण) एक सस्ती, आमतौर पर इस्तेमाल समाशोधन एजेंट, जो हैबहुत जल्दी नमूने समाशोधन का लाभ। BABB आधारित समाशोधन और इमेजिंग तकनीक तंत्रिका विज्ञान के नमूने और विभिन्न अंगों 10-13 के लिए पहले से वर्णित किया गया है। 15.5 – यहाँ हम ई (भ्रूण दिन) 11.5 से murine दिल में रक्त वाहिकाओं की परीक्षा के लिए विशेष संदर्भ के साथ confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा किया immunostained नमूनों की BABB मंजूरी के लिए एक मजबूत और सरल तकनीक का वर्णन है,। हालांकि, के रूप में भी प्रदर्शित किया गया है, इस तकनीक को समान रूप से अच्छी तरह से पूरे भ्रूण के विश्लेषण, साथ ही अन्य प्रकार की कोशिकाओं के लिए लागू किया जा सकता है, जब तक ब्याज की मार्कर के रूप में उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी उपलब्ध हैं।
पूरे भ्रूण दिलों में कोरोनरी वाहिकाओं विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी ऑप्टिकल निकासी और confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा पीछा के साथ wholemount immunostaining द्वारा imaged थे। सरल विधि यहाँ BABB साथ भ्रूण माउस दिल की निकासी के लिए वर्णित है, ऑप्टिकल पैठ बढ़ जाती है और रक्त वाहिकाओं महाधमनी और वेंट्रिकुलर दीवारों में अनुवादित की उच्च संकल्प छवियों का कब्जा सक्षम बनाता है। ऐसे Vectashield (अपवर्तनांक 1.45) के रूप में ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते अभिकर्मकों भी कोरोनरी वाहिका 22 तथापि BABB के उच्च अपवर्तनांक (1.56) अभी भी आगे प्रकाश बिखरने कम कर देता है, गहरी ऊतक प्रवेश को सक्षम करने की इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया है। ऊतक निकासी के इस तरह के multiphoton और प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी जो कम आसानी से शोधकर्ताओं के लिए उपलब्ध हो सकता है के रूप में माइक्रोस्कोपी के और अधिक जटिल, महंगी रूपों के लिए जरूरत obviates। समाशोधन प्रक्रिया अन्य तरीकों 6-9 करने के लिए और छोटे नमूने CA हो सकता है की तुलना में बहुत तेजी से हैसीधे माइक्रोस्कोपी पकवान पर अभिकर्मकों की छोटी मात्रा का उपयोग कर बाहर rried। वाहिका की मजबूत धुंधला आदेश उच्च गुणवत्ता के चित्र प्राप्त करने के लिए आवश्यक है; विरोधी PECAM1 एंटीबॉडी चयनित किया गया था के रूप में यह कोरोनरी ईसीएस और वाणिज्यिक एंटीबॉडी के एक नंबर के सभी प्रकार के निशान धुंधला की उपयुक्त उच्च स्तर देने के लिए पाए गए। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट धुंधला BABB में अत्यंत स्थिर होने के लिए प्रकट होता है; BABB में कमरे के तापमान पर संग्रहित नमूने (प्रकाश से सुरक्षित) कई महीनों के लिए अपने फ्लोरोसेंट संकेत बनाए रखा। तथ्य यह है कि PECAM1 एंटीबॉडी कुशलता, साथ ही वाहिका कभी कभी समस्याग्रस्त था कोरोनरी अंतर्हृदकला लेबल खासकर जब peritruncal जाल की छवियों पर कब्जा। peritruncal ईसीएस की तुलना में महाधमनी लुमेन की मजबूत धुंधला छवियों के कुछ क्षेत्रों में अधिक संतृप्ति के एक जोखिम में हुई है, जिसका अर्थ है कि इमेजिंग मापदंडों के सावधान समायोजन आवश्यक था। आदर्श रूप में, एक एंटीबॉडी धुंधला केवल संवहनी ईसीएस इस्तेमाल किया जा सकता है; प्रयोग में,हालांकि, उपयुक्त एंटीबॉडी कि wholemount धुंधला की अपेक्षित स्तर उपज पाने के लिए मुश्किल हो सकता है। हाल ही में, फैटी एसिड बाध्यकारी प्रोटीन 4 (FABP4) कोरोनरी संवहनी ईसीएस 23 के एक मार्कर होना दिखाया गया है और इसलिए PECAM1 के लिए एक विकल्प का प्रतिनिधित्व कर सकते।
आदेश महाधमनी और दिल कक्षों नमूने फ्लैट पर चढ़कर नहीं थे की 3 डी आकृति विज्ञान बनाए रखने के लिए, लेकिन बजाय गिलास तली व्यंजन में imaged थे। नमूनों की गहराई imaged किया जा करने के लिए अपने छोटे से काम दूरी की वजह से, उच्च बढ़ाई उद्देश्यों के उपयोग रोका। हालांकि उच्च संकल्प छवियों अभी भी पिक्सेल ध्यान केन्द्रित करना समय बढ़ रही है और छवि पर कब्जा करने के लिए कम से कम 1024 x 1024 के एक पिक्सेल सरणी के आकार का उपयोग करके एक 10x उद्देश्य का उपयोग प्राप्त थे। इस संरचना और कोरोनरी वाहिकाओं के वितरण के विश्लेषण के लिए पर्याप्त था, लेकिन सेलुलर संरचना के महीन विश्लेषण नमूनों की फ्लैट बढ़ते आवश्यकता हो सकती है। बढ़ते के लिए दिल के अलग अलग हिस्सों के विच्छेदन,उदाहरण के लिए, निलय दीवारों, या महाधमनी, यह भी आवश्यक हो सकता है। वैकल्पिक रूप से, अधिक नमूना छवि deconvolution के द्वारा पीछा के आदेश संकल्प और संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए किया जा सकता है; हालांकि यह काफी लंबे समय तक बार स्कैनिंग की आवश्यकता है और बहुत बड़ी छवि फ़ाइलों कि कंप्यूटिंग पर कार्रवाई करने के लिए बिजली की बहुत आवश्यकता है बनाता है।
E15.5 करने के लिए दिल को सफलतापूर्वक इस पद्धति का उपयोग imaged किया गया है, और यह भी पूरे भ्रूण की वाहिका (कम से कम E11.5 तक) का विश्लेषण करने के लिए एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग संभव है। अन्य प्रकार की कोशिकाओं, जैसे, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं को भी इस तकनीक का उपयोग हमारी प्रयोगशाला में imaged किया गया है। मोटा ऊतकों, जैसे, दिल E15.5 से अधिक पुराने के लिए, एंटीबॉडी पैठ एक सीमित कारक हो सकता है; अब incubations और / या बढ़ा डिटर्जेंट की आवश्यकता हो सकती है। इसके अलावा, जब छवियों की एक बड़ी Z ढेर इकट्ठा करने के संकेत के रूप लेज़रों ऊतक के दूर भागों घुसना ताकत को कम किया जा सकता है; हालांकि confOcal सेटिंग्स बढ़ती Z दूरी के साथ लेजर शक्ति बढ़ाने के लिए समायोजित किया जा सकता है।
इस विधि दोनों कोरोनरी वाहिनियों के गठन के शुरुआती दौर और बाद में विकास के चरणों में कोरोनरी धमनियों की patterning के confocal सूक्ष्म विश्लेषण की सुविधा। वितरण, शाखाओं में बंटी है और रक्त वाहिकाओं की संरचना के बारे में विस्तृत जानकारी कम समय में प्राप्त किया जा सकता है, इस angiogenesis रास्ते में विशिष्ट दोष के साथ आनुवंशिक माउस म्यूटेंट के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बना रही है।
The authors have nothing to disclose.
काम ब्रिटिश हार्ट Foundation'and राष्ट्रीय बाल एनएचएस फाउंडेशन ट्रस्ट और यूनिवर्सिटी कॉलेज लंदन के लिए ग्रेट ऑरमंड स्ट्रीट हॉस्पिटल में स्वास्थ्य अनुसंधान बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर के लिए संस्थान द्वारा समर्थित द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Forceps | FST | 11251-30 | |
10cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
35mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter | FST | 26002-20 | |
Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
1000ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
48-well plate | Falcon | 353078 | |
Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20°C |
100% methanol | VWR | 20847307 | |
Tween®20 | Sigma | P1379 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
Image J software | NIH | Freeware |