Vi presenterar ett protokoll för analys av kranskärlen i hela embryonala murina hjärtan upp till E15.5, användning av standardimmunologiska färgningsmetoder följt av optisk clearance och konfokalmikroskopi. Denna teknik möjliggör visualisering av blodkärl i hela hjärtat utan behov av tidsödande analys av seriella sektioner.
Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.
Inrättande av ett fungerande koronar nätverk är avgörande för hjärtats funktion och embryonal utveckling och analys av genetiska mutanter mus kan ge värdefull insikt i de molekylära signaler som ligger bakom denna utvecklingsprocess. Förmågan att visualisera embryonala hjärt plexus som en helhet, snarare än presenteras i en serie av histologiska sektioner, är nödvändig för att underlätta analysen av fartygets mönstring i genetiska mutanter, och undviker den potentiella förlusten av information som kan uppstå som en följd av mekanisk skivning av vävnaden. Fartyg ödesbestämd att bilda artärer och kapillärer är lokaliserade djupt inom väggarna i både kamrarna och aorta 1-3. Men medan fluorescensmärkning av celler i kombination med laserskanning konfokalmikroskopi kan ge högupplösta bilder av wholemount-märkt ytliga venösa / lymfkärl 4,5, är djupet av avbildning begränsas genom optisk penetration. Högupplöst avbildning av locketillaries och artärer under hela djupet av hjärtat är därför inte möjlig utan någon form av vävnad clearing.
Dålig optisk penetrering orsakas av högt brytningsindex av den multipla cellulära och extracellulära (t.ex. kollagen och elastiska fibrer) komponenter av tjocka vävnader. Detta sprider bild ljus, vilket oskärpa och minskad kontrast. Clearinginstitut matcha typiskt högt brytningsindex av sådana vävnader, vilket innebär att ljuset kan färdas genom provet obehindrad och tränga djupare in i vävnaden. Innan clearing, vävnader i allmänhet uttorkad som vatten har en relativt lågt brytningsindex. En uppsjö av nya clearing metoder har utvecklats nyligen, men beroende på den teknik som används, kan clearingprocessen ta dagar eller veckor och kan kräva kostsamma reagens 6-9. BABB (en 1: 2 blandning av bensylalkohol och bensylbensoat) är ett billigt, som vanligen används renande ämne, som har denFördelen med att rensa prover extremt snabbt. BABB-baserade clearing och avbildningstekniker har beskrivits tidigare för neurologiska prover och olika organ 10-13. Här beskriver vi en robust och enkel teknik för BABB clearance av immun prover följt av konfokalmikroskopi, med särskild hänvisning till en undersökning av blodkärl i murina hjärtan från E (embryonal dag) 11,5-15,5. Emellertid, såsom har även visats, tekniken kan lika väl tillämpas på analys av hela embryon, såväl som andra celltyper, så länge som högkvalitativa antikroppar mot markörerna av intresse föreligger.
Kranskärlen i hela embryonala hjärtan avbildades av wholemount immunfärgning med anti-PECAM1 antikropp följt av optisk clearance och konfokalmikroskopi. Den enkla metod som beskrivs här, för avslutande av embryonala mus hjärtan med BABB ökar optisk penetration och möjliggör fångst av högupplösta bilder av blodkärl lokaliserade i aorta och ventrikulära väggarna. Glycerolbaserat monterings reagens såsom Vectashield (brytningsindex 1,45) har också använts för avbildning av kranskärlen 22 dock det högre brytningsindexet för BABB (1,56) minskar ljusspridning ytterligare, vilket möjliggör djupare vävnadspenetrering. Vävnads clearance undanröjer behovet av mer komplexa och dyra former av mikroskopi såsom multifoton och ljus ark mikroskop som kan vara mindre lätt tillgängliga för forskare. Clearingprocessen är extremt snabb jämfört med andra metoder 6-9 och för små prover kan vara carried med användning av små volymer av reagens direkt på mikroskopi skålen. Robust färgning av vaskulaturen krävs för att uppnå bilder med hög kvalitet; anti-PECAM1 antikropp valdes eftersom det markerar alla typer av koronar EC och ett antal kommersiella antikroppar befanns ge lämpligt höga nivåer av färgning. Dessutom förefaller den fluorescerande färgning för att vara extremt stabila i BABB; prov lagrade vid rumstemperatur i BABB (skyddade från ljus) behöll sin fluorescerande signal i flera månader. Det faktum att PECAM1 Antikroppen märker effektivt krans endokardiet liksom kärl var ibland problematiskt, särskilt när du tar bilder av peritruncal plexus. Starkare färgning av aorta lumen jämfört med peritruncal EC resulterade i en risk för övermättnad i vissa delar av bilderna, vilket innebär att noggrann justering av bildparametrar krävdes. Helst en antikropp färgning endast kärl EC skulle användas; i praktiken,emellertid kan finna lämpliga antikroppar som ger den erfordrade nivån av wholemount färgning vara svårt. Nyligen har fettsyrabindande protein 4 (FABP4) visat sig vara en markör för kranskärls EC 23 och kan därför utgöra ett alternativ till PECAM1.
För att behålla den 3D morfologin av aorta och hjärtkamrar proverna var inte platt-monterade, men var istället avbildas i glas botten rätter. Djupet av proven som skall avbildas förhindrade användningen av höga mål förstoring, på grund av deras korta arbetsavstånd. Men högupplösta bilder fortfarande kan uppnås med hjälp av en 10X mål genom att öka pixel uppehållstid och med hjälp av en pixelmatrisstorlek på minst 1024 x 1024 för bildfångst. Detta var tillräckligt för analys av struktur och fördelning av kranskärlen, men finare analys av cellstruktur kan kräva platt-montering av proverna. Dissektion av enskilda delar av hjärtat för montering,t.ex. ventrikeln väggar, eller aorta, kan också vara nödvändigt. Alternativt översampling av bilden följt av avfaltning kan utföras för att öka upplösning och känslighet; Detta kräver dock betydligt längre skanning gånger och skapar mycket stora bildfiler som kräver en hel del datorkraft för att bearbeta.
Hjärtan upp till E15.5 styrde avbildas med den här metoden, och det är också möjligt att analysera kärlsystemet i hela embryon (upp till minst E11.5) med användning av samma protokoll. Andra celltyper, t.ex., glatta muskelceller har också avbildats i vårt laboratorium med användning av denna teknik. För tjockare vävnader, till exempel, hjärtan äldre än E15.5, kan penetrationsantikroppen vara en begränsande faktor; längre inkubationer och / eller ökad rengöringsmedel kan behövas. Dessutom, när du samlar en stor z bunt bilder signalstyrka kan minskas lasrarna penetrera längst delar av vävnad; men confocal inställningar kan justeras för att öka lasereffekt med ökande z avstånd.
Denna metod underlättar konfokala mikroskopisk analys av både de tidigaste stadierna av kranskärlbildning och mönstring av kranskärlen på senare utvecklingsstadier. Detaljerad information om distribution, förgrening och struktur av blodkärl kan förvärvas på kort tid, vilket gör detta ett värdefullt verktyg för att studera genetiska mus mutanter med specifika defekter i angiogenes vägar.
The authors have nothing to disclose.
Arbetet har finansierats av British Heart Foundation'and stöds av National Institute for Health Research Biomedical Research Centre vid Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust och University College London.
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Forceps | FST | 11251-30 | |
10cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
35mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter | FST | 26002-20 | |
Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
1000ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
48-well plate | Falcon | 353078 | |
Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20°C |
100% methanol | VWR | 20847307 | |
Tween®20 | Sigma | P1379 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
Image J software | NIH | Freeware |