Vi presenterer en protokoll for analyse av koronarkar i hele embryoniske muse-hjerter opp til E15.5, ved hjelp av standard immunologiske farvemetoder etterfulgt av optisk klaring og konfokal mikroskopi. Denne teknikken gjør det mulig for visualisering av blodårene i hele hjertet uten behov for tidkrevende analyse av seriesnitt.
Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.
Etablering av et fungerende koronar nettverk er avgjørende for hjertefunksjon og embryoutvikling og analyse av genetiske mus mutanter kan gi verdifull innsikt i de molekylære signaler bak denne utviklingsprosess. Evnen til å visualisere de embryoniske koronar plexus som en helhet, heller enn angitt i en serie av histologiske snitt, er vesentlig for å lette analysen av fartøyet mønster i genetiske mutanter, og unngår det potensielle tap av informasjon som kan oppstå som et resultat av mekanisk kutting av vevet. Fartøy skjebnebestemt til å danne arterier og kapillærer er lokalisert dypt innenfor veggene i begge ventriklene og aorta 1-3. Men mens fluorescerende merking av celler kombinert med laser-scanning konfokalmikroskopi kan gi høyoppløselige bilder av wholemount-merket overfladiske vene / lymfekar 4,5, er dybden av bildebehandling begrenset av optisk penetrasjon. Høyoppløselig avbildning av capillaries og arterier gjennom hele dybden av hjertet er derfor ikke mulig uten noen form for vev clearing.
Dårlig optisk gjennomtrengning er forårsaket av den høye brytningsindeksen for den multiple cellulære og ekstracellulære (f.eks kollagen- og elastiske fibrer) komponenter av tykk vev. Dette sprer bilde lys, forårsaker uskarphet og redusert kontrast. Oppgjørs midler vanligvis samsvare med høy brytningsindeks på slike vev, noe som betyr at lys kan reise gjennom prøven uhindret og trenge dypere inn i vevet. Før rensing, vev er vanligvis dehydrert som vann har en forholdsvis lav brytningsindeks. En mengde nye clearing metoder har nylig blitt utviklet, men avhengig av teknikken som brukes, kan det clearing prosessen ta dager eller uker, og kan kreve kostbare reagenser 6-9. BABB (en 1: 2 blanding av benzylalkohol og benzylbenzoat) er en billig, som vanligvis brukes clearingmiddel, som har denFordelen med å rydde prøvene svært raskt. BABB basert avregning og avbildningsteknikker har blitt beskrevet tidligere for nevrologiske prøver og ulike organer 10-13. Her beskriver vi en robust og enkel teknikk for BABB clearance av immunostained prøver etterfulgt av konfokal mikroskopi, med spesiell henvisning til undersøkelse av blodårer i murine hjerter fra E (embryonale dag) 11,5 til 15,5. Imidlertid, slik det også er vist, teknikken kan like godt anvendes for analyse av hele embryoer, så vel som andre celletyper, så lenge høy kvalitet antistoffer mot markører av interesse er tilgjengelig.
Koronar fartøy i hele embryonale hjerter ble fotografert av wholemount farging med anti-PECAM1 antistoff etterfulgt av optisk klaring og konfokalmikroskopi. Den enkle metoden beskrevet her, for clearance av embryonale mus hjerter med BABB, øker optisk penetrasjon og muliggjør fangst av høyoppløselige bilder av blodårer lokalisert i aorta og kammerveggene. Glycerol-baserte monterings reagenser slik som Vectashield (brytningsindeks 1,45) har også vært anvendt for avbildning av den koronare blodkar 22 imidlertid den høyere brytningsindeksen for BABB (1,56) reduserer lysspredning ytterligere, slik at dypere vev penetrasjon. Tissue klaring unngår behovet for mer komplekse og kostbare former av mikroskopi som multiphoton og lys-mikroskopi ark som kan være mindre lett tilgjengelig for forskere. Clearing prosessen er svært rask i forhold til andre metoder 6-9 og for små prøver kan være carried ut ved hjelp av små mengder reagenser direkte på mikros fatet. Robust farging av blodkar er nødvendig for å oppnå bilder av høy kvalitet; anti-PECAM1 antistoff ble valgt som den markerer alle typer av koronar ECS og en rekke kommersielle antistoffer ble funnet å gi egnet høye nivåer av farging. I tillegg vises det fluorescerende farging for å være ekstremt stabile i Babb; prøver lagret ved værelsestemperatur i Babb (beskyttet fra lys) beholdt sitt fluorescente signal i flere måneder. Det faktum at PECAM1 antistoff effektivt etiketter koronar endocardium samt blodkar var tidvis problematisk, spesielt når du tar bilder av peritruncal plexus. Sterkere farging av aorta lumen sammenlignet med peritruncal ECS resulterte i en fare for overmetning i enkelte områder av bildene, noe som betyr at nøye justering av bildeparametrene var nødvendig. Ideelt sett, en antistoffarging bare vaskulær ECS ville bli brukt; i praksis,imidlertid finne egnede antistoffer som gir det ønskede nivå av wholemount farging kan være vanskelig. Nylig har fettsyre-bindende protein 4 (FABP4) blitt vist å være en markør for koronar vaskulær ECS 23, og kan derfor representere et alternativ til PECAM1.
For å beholde 3D morfologi av aorta og hjertekamrene prøvene ikke var flat montert, men i stedet ble avbildet i glassbunn retter. Dybden av prøvene som skal avbildes utelukket bruken av høy forstørrelse mål, på grunn av deres korte arbeids avstander. Men høyoppløselige bilder fortsatt var mulig å bruke en 10X objektiv ved å øke pixel holdetid og bruke en piksel rekke størrelse på minst 1024 x 1024 for bildeopptak. Dette var tilstrekkelig for analyse av strukturen og fordelingen av koronarkarene, men finere analyse av cellestrukturen kan kreve flat montering av prøver. Disseksjon av de enkelte deler av hjertet for montering,f.eks ventrikkel vegger, eller aorta, kan også være nødvendig. Alternativt kan over-sampling av bildet, etterfulgt av dekonvolvering kan utføres for å øke oppløsning og sensitivitet; Dette krever imidlertid betydelig lengre skanning ganger og skaper svært store bildefiler som krever mye datakraft for å behandle.
Hjerter opp til E15.5 ble med hell avbildes ved hjelp av denne metoden, og det er også mulig å analysere vaskulaturen av hele embryoer (opp til minst E11.5) ved bruk av samme protokoll. Andre celletyper, for eksempel, glatte muskelceller Det er også avbildet i vårt laboratorium ved hjelp av denne teknikken. For tykkere vev, for eksempel, hjerter eldre enn E15.5, kan antistoffet penetrasjon være en begrensende faktor; lengre inkubasjoner og / eller økt vaskemiddel kan være nødvendig. I tillegg, når samle en stor z stabel av bilder signalstyrken kan reduseres som lasere trenge inn i de fjerneste partier av vev; men confocal innstillinger kan justeres for å øke laser makt med økende z avstand.
Denne metoden muliggjør konfokal mikroskopisk analyse av begge de tidligste stadiene av koronar fartøy dannelse og fordelingen av koronararteriene på senere utviklingsstadier. Detaljert informasjon om fordeling, forgrening og struktur av blodkar kan bli kjøpt opp i løpet av kort tid, noe som gjør dette til et verdifullt verktøy for å studere genetiske mus mutanter med spesifikke defekter i angiogenese veier.
The authors have nothing to disclose.
Arbeidet ble finansiert av British Heart Foundation'and støttet av National Institute for Health Research Biomedical Research Centre ved Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust og University College London.
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Forceps | FST | 11251-30 | |
10cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
35mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter | FST | 26002-20 | |
Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
1000ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
48-well plate | Falcon | 353078 | |
Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20°C |
100% methanol | VWR | 20847307 | |
Tween®20 | Sigma | P1379 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
Image J software | NIH | Freeware |