Vi præsenterer en protokol til analyse af koronarkar i hele embryonale murine hjerter op til E15.5, ved hjælp af standard immunologiske farvningsmetoder efterfulgt af optisk clearance og konfokal mikroskopi. Denne teknik muliggør visualisering af blodkar i hele hjertet uden behov for tidskrævende analyse af serielle sektioner.
Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.
Etablering af en velfungerende koronar netværk er afgørende for hjertefunktionen og embryonale udvikling, og analyse af genetiske musen mutanter kan give værdifuld indsigt i de molekylære signaler underliggende denne udviklingsproces. Evnen til at visualisere embryonale koronar plexus som helhed, snarere end præsenteret i en række histologiske snit, er afgørende for at lette analysen af fartøjets mønster i genetiske mutanter, og undgår potentielle tab af oplysninger, der kan opstå som følge af mekanisk snitning af vævet. Fartøjer skæbnebestemt til at danne arterier og kapillærer er lokaliseret dybt inden for murene i både hjertekamrene og aorta 1-3. Men mens fluorescerende mærkning af celler kombineret med laser-scanning konfokal mikroskopi kan give billeder af wholemount-mærket overfladiske venøse / lymfekar 4,5 høj opløsning, er dybden af billeddannelse begrænset af optisk penetration. Høj opløsning billeddannelse af hætteillaries og arterier gennem hele dybden af hjertet er derfor ikke muligt uden en eller anden form for væv clearing.
Dårlig optisk penetration skyldes det høje brydningsindeks for det multiple cellulære og ekstracellulære (fx kollagen og elastiske fibre) komponenter af tykke væv. Dette spreder billeddannende lys, der forårsager sløring og nedsat kontrast. Afhjælpning midler typisk matche højt brydningsindeks af sådanne væv, hvilket betyder, at lyset kan rejse gennem prøven uhindret og trænge dybere ind i vævet. Før clearing, væv er generelt dehydratiseret som vand har et relativt lavt brydningsindeks. En overflod af nye clearing metoder er blevet udviklet for nylig, men afhængigt af den anvendte teknik kan clearingen tage dage eller uger, og kan kræve kostbare reagenser 6-9. Babb (en 1: 2 blanding af benzylalkohol og benzylbenzoat) er en billig, almindeligt anvendt klarende middel, som har denFordelen ved at rydde prøver ekstremt hurtigt. Babb-baserede clearing og billeddannelsesteknikker er tidligere blevet beskrevet for neurologiske prøver og forskellige organer 10-13. Her beskriver vi en robust og ligetil teknik til Babb clearance af immunofarvede prøver efterfulgt af konfokal mikroskopi, med særlig henvisning til en undersøgelse af blodkar i murine hjerter fra E (embryonale dag) 11,5-15,5. Men som det også blevet vist, at teknikken kan lige så godt anvendes til analyse af hele embryoner, såvel som andre celletyper, så længe høj kvalitet antistoffer mod markørerne af interesse er til rådighed.
Koronarkar i hele embryonale hjerter blev afbildet ved wholemount immunfarvning med anti-PECAM1 antistof efterfulgt af optisk clearance og konfokal mikroskopi. Den enkle metode beskrevet her, for afslutningen af embryonale mus hjerter med Babb, øger optisk penetration og muliggør indfangning af højopløselige billeder af blodkar lokaliseret i aorta og ventrikulære vægge. Glycerol-baserede monteringsmuligheder reagenser såsom Vectashield (brydningsindeks 1,45) er også blevet anvendt til billeddannelse af koronare vaskulatur 22 dog den højere brydningsindeks af Babb (1,56) reducerer lysspredning yderligere, muliggør dybere væv penetration. Tissue clearance overflødiggør behovet for mere komplekse, dyre former for mikroskopi såsom multifoton og lys ark mikroskopi som kan være mindre let tilgængelige for forskere. Den clearing proces er yderst hurtig i forhold til andre metoder 6-9, og for små prøver kan være carried under anvendelse små volumener af reagenser direkte på mikroskopi skålen. Robust farvning af vaskulaturen er påkrævet for at opnå billeder af høj kvalitet; anti-PECAM1 antistof blev valgt som det markerer alle typer koronar EC'er og en række kommercielle antistoffer viste sig at give passende høje niveauer af farvning. Derudover synes den fluorescerende farvning at være yderst stabil i Babb; prøver opbevaret ved stuetemperatur i Babb (beskyttet mod lys) bevarede deres fluorescerende signal i flere måneder. Det faktum, at PECAM1 antistof effektivt mærker koronar endokardium samt vaskulaturen var lejlighedsvis problematisk, især når du tager billeder af peritruncal plexus. Stærkere farvning af aorta lumen i forhold til peritruncal EC'er resulterede i en risiko for over-mætning i nogle områder af billederne, hvilket betyder, at omhyggelig justering af de billeddannende parametre var påkrævet. Ideelt, et antistof-farvning kun vaskulær EC'er ville blive brugt; i praksis,dog finde egnede antistoffer, der giver det krævede niveau af wholemount farvning kan være svært. For nylig er fedtsyrebindende protein 4 (FABP4) blevet vist at være en markør for koronar vaskulær EC'er 23 og kan derfor udgøre et alternativ til PECAM1.
For at fastholde 3D morfologi aorta og hjertekamre prøverne ikke var fast monteret, men blev i stedet afbildet i glas-bund retter. Dybden af de prøver, der skal afbildes udelukket anvendelsen af høje forstørrelsesobjektiver, på grund af deres korte arbejdstid afstande. Dog høj opløsning stadig var opnåelige ved hjælp af en 10X målsætning ved at øge pixel opholdstid og bruge en pixel array-størrelse på mindst 1024 x 1024 for billedoptagelse. Dette var tilstrækkeligt til analyse af strukturen og distribution af koronarkar, men finere analyse af cellestruktur kan kræve fladskærms-montering af prøver. Dissektion af individuelle dele af hjertet for montering,f.eks ventrikel vægge, eller aorta, kan også være nødvendig. Alternativt over-sampling af billedet efterfulgt af udfoldning kan udføres for at øge opløsning og følsomhed; dette kræver dog betydeligt længere scanning gange og skaber meget store billedfiler, der kræver en masse computerkraft til at behandle.
Hjerter op til E15.5 lykkedes afbildes ved hjælp af denne metode, og det er også muligt at analysere vaskulaturen af hele embryoner (op til mindst E11.5) under anvendelse af den samme protokol. Andre celletyper, f.eks, glatte muskelceller er også blevet afbildet i vores laboratorium under anvendelse af denne teknik. For tykkere væv, fx, hjerter ældre end E15.5, kan penetration antistof være en begrænsende faktor; kan kræves længere inkuberinger og / eller øget detergent. Hertil kommer, når indsamling af en stor z stabel af billeder signalstyrken kan blive reduceret som laserne trænger de fjerneste dele af væv; men confocal indstillinger kan justeres for at øge laserenergi med stigende z afstand.
Denne metode letter konfokal mikroskopisk analyse af både de tidligste stadier af koronarkar dannelse og mønster af kranspulsårerne på senere udviklingsstadier. Detaljerede oplysninger om distribution, forgrening og struktur af blodkar kan erhverves på kort tid, hvilket gør dette til et værdifuldt redskab for studiet af genetiske mus mutanter med specifikke defekter i angiogenese veje.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet blev finansieret af British Heart Foundation'and støttet af National Institute for Health Research Biomedical Research Centre på Great Ormond Street Hospital for Children NHS Foundation Trust og University College London.
PBS | Life Technologies | 14190-094 | |
Forceps | FST | 11251-30 | |
10cm Petri dishes | Falcon | 351029 | |
35mm Petri dishes | Sigma | P5112 | |
Stainless steel minutien pins 0.2mm diameter | FST | 26002-20 | |
Fine tip pastettes | Alpha Laboratories | LW4061 | |
1000ml pipette tips | Sorenson | 34000 | |
48-well plate | Falcon | 353078 | |
Kwik-Gard | World Precision Instrument | KWIKGARD | Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing |
Kwik-Gard refill | World Precision Instrument | KWIKGLUE | Refill cartridges and dispensing tips |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Make up in PBS and store at -20°C |
100% methanol | VWR | 20847307 | |
Tween®20 | Sigma | P1379 | |
Goat serum | Sigma | G9023 | |
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse | BD Pharmingen | 553370 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal | Abcam | ab28364 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal | Thermo Fisher Scientific | MA3105 | Primary antibody, dilute 1 in 400 |
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc-65495 | Primary antibody, dilute 1 in 50 |
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab14106 | Primary antibody, dilute 1 in 250 |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11007 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | Secondary antibody, dilute 1 in 500 | |
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Abcam | ab173003 | |
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A21208 | Secondary antibody, dilute 1 in 500 |
Phenolic screw cap | Wheaton | 240408 | |
Benzyl alcohol | Sigma | 402834 | |
Benzyl benzoate | Sigma | B6630 | |
Imaris | Bitplane Imaging | image analysis software | |
Image J software | NIH | Freeware |