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Developmental Biology

Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz

doi: 10.3791/54800 Published: December 7, 2016

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll für die Analyse der Herzkranzgefäße in ganzen embryonalen Maus-Herzen bis E15.5, durch optische Clearance und der konfokalen Mikroskopie, gefolgt von immunologischen Standard Färbemethoden verwendet wird. Diese Technik ermöglicht die Darstellung von Blutgefäßen während des gesamten Herzens ohne die Notwendigkeit für zeitaufwendige Analyse von Serienschnitten.

Introduction

ein funktionierendes koronarer Netzwerk aufzubauen ist von entscheidender Bedeutung für die Herzfunktion und die embryonale Entwicklung und Analyse von genetischen Mausmutanten wertvolle Einblicke in die molekularen Signale liefern können diesen Entwicklungsprozess zugrunde liegen. Die Fähigkeit, die embryonale koronaren Plexus als Ganzes sichtbar zu machen, als vielmehr in einer Reihe von histologischen Schnitten dargestellt, ist wesentlich, um die Analyse von Gefäßmusterungs in genetische Mutanten zu erleichtern, und verhindert den möglichen Verlust von Informationen, die als Ergebnis der mechanischen auftreten kann Schneiden des Gewebes. Gefäße seligen Arterien und Kapillaren zu bilden , sind lokalisierte tief in den Wänden der beiden Kammern und der Aorta 1-3. Während jedoch die Fluoreszenzmarkierung von mit Laser-Scanning - konfokale Mikroskopie kombiniert Zellen können venöse / Lymphgefäße 4,5, hochauflösende Bilder von oberflächlichen Wholemount-markierten bieten die Tiefe der Bildgebung wird durch optische Durchdringung begrenzt. Hochauflösende Bildgebung der Kappeillaries und Arterien während der gesamten Tiefe des Herzens ist daher ohne irgendeine Form von Gewebe Clearing nicht möglich.

Schlechte optische Eindringtiefe wird durch den hohen Brechungsindex der mehreren zellulären und extrazellulären (zB Kollagen und elastischen Fasern) -Komponenten von dicken Geweben verursacht. Diese streut das Abbildungslicht, was zu Unschärfen und verringert den Kontrast. Clearingstellen entsprechen typischerweise den hohen Brechungsindex von solchen Geweben, was bedeutet, dass das Licht durch die Probe bewegen kann ungehindert und dringen tiefer in das Gewebe. Vor dem Clearing, sind Gewebe im Allgemeinen dehydriert als Wasser mit einem relativ niedrigen Brechungsindex aufweist. Eine Fülle von neuen Clearing - Verfahren wurden je nach der verwendeten Technik vor kurzem jedoch entwickelt, kann das Clearing - Verfahren Tage oder Wochen dauern und kostspieliger Reagenzien 6-9 erfordern. BABB (a 1: 2-Mischung aus Benzylalkohol und Benzylbenzoat) ist eine kostengünstige, häufig verwendete Clearingstelle, die das hatVorteil der Proben extrem schnell zu löschen. BABB basierte Clearing- und Abbildungstechniken wurden für neurologische Proben und verschiedene Organe 10-13 zuvor beschrieben. Hier beschreiben wir eine robuste und einfache Technik für die BABB Clearance von immunhistochemisch Proben mittels konfokaler Mikroskopie gefolgt, mit besonderem Bezug auf die Untersuchung von Blutgefäßen in murinen Herzen von E (embryonaler Tag) 11,5-15,5. Wie jedoch wurde auch gezeigt, kann die Technik genauso gut auf die Analyse von ganzen Embryos angewendet werden, wie auch andere Zelltypen, solange hochwertige Antikörper gegen die Marker von Interesse zur Verfügung stehen.

Protocol

Alle Tierforschung wurde gemäß den Richtlinien des Instituts unter der Lizenz von der britischen Home Office durchgeführt.

1. Dissection und Fixierung von Embryonic Herzen

  1. Euthanize eine zeitlich schwangeren Maus auf den gewünschten Tag eine ethisch genehmigt Culling - Technik, zum Beispiel CO 2 narcosis gefolgt von Zervikaldislokation verwenden, und entfernen Sie die embryonale Säcke 14, so dass sie in einer 10 cm Petrischale mit phosphatgepufferter Salzlösung gefüllt platzieren (PBS) .
  2. Mit einem Binokular und einer Pinzette vorsichtig die Gebärmutter-Säckchen öffnen und jeden Embryo zu entfernen, die Nabelschnur Abtrennen und den Dottersack zu entfernen.
  3. Für die Genotypisierung Zwecke, entfernen Sie die embryonale Schwanz und in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für die Lyse / DNA-Extraktion später.
  4. Um das Herz, pin jeder Embryo aus auf dem Rücken in einem PBS-gefüllten Silikonelastomer beschichtete 35 mm Petrischale mit Edelstahl minutien Stifte zu entfernen. Mit einer feinen Pinzette, carefully die Truhe öffnen und trennen die großen Gefäße, anterioren zum Herzen. Dann erreichte mit der Zange hinter dem Herzen, fassen die Schiffe hinter dem Herzen und ziehen Sie das Herz zu entfernen; die Lungen weg kommen können auch gleichzeitig an.
  5. Übertragen Sie das Herz in ein frisches 35 mm Petrischale mit PBS und verwenden feinen Pinzette das Lungengewebe zu wegschneiden, falls erforderlich. Dann übertragen, das Herz zu einer Vertiefung einer 48-Well-Platte mit kaltem PBS gefüllt.
  6. Sie alle Herzen in der 48-Well-Platte absaugen PBS mit einem spitzen Plastik Pasteur-Pipette und ersetzen mit 0,5 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) Nach dem Sammeln.
    ACHTUNG: PFA ist ein bekanntes allergen, krebserregend zu sein, und giftig.
    1. Fix E11,5 - 12,5 Herzen für 15 min, E13.5 Herzen für 20 min und E14,5 - 15,5 Herzen für 30 min in 4% PFA bei Raumtemperatur.
  7. Saugen Sie das PFA mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette und spülen Sie die Herzen 2x in kaltem PBS.
    CAUTION: PFA ist gefährlich und müssen in Einklang mit den institutionellen Vorschriften entsorgt werden.
  8. Wenn sie nicht sofort für ganze Berg Immunfärbung mit (siehe Abschnitt 2), dehydrieren die Herzen durch aufeinanderfolgende 5 min Waschen in den folgenden Lösungen Durchführung: 25% Methanol / 75% PBS, 50% Methanol / 50% PBS, 75% Methanol / 25 % PBS.
    VORSICHT: Methanol ist giftig, Handschuhe zu tragen. Lagern Sie die Herzen bei -20 ° C in 100% Methanol.

2. Ganze Berge Immunostaining embryonaler Herzen mit Anti-PECAM1 Antikörper

HINWEIS: Anti-PECAM1 Antikörper eignen sich gut für die Herzkranzgefäße Färbung (siehe Schritt 2.4), aber jede pan-endothelialen Marker, der ein robustes Signal gibt wäre geeignet.

  1. Bei der Verwendung von Herzen, die in 100% Methanol gespeichert wurden, übertragen auf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und rehydratisieren durch aufeinanderfolgende 5 min Waschen in den folgenden Lösungen Durchführung: 75% Methanol / 25% PBS, 50% Methanol / 50% PBS und 25% Methanol / 75% PBS. Permeabilisierung die Herzen, indem man 3 x 10 min Waschen in 0,5 bis 1,0 ml PBST (PBS / 0,1% Tween-20), Drehen bei Raumtemperatur.
  2. Blockieren Sie die Herzen durch Drehen für 1 Stunde bei Raumtemperatur in 1,0 ml 10% Ziegenserum in PBST.
  3. Entfernen Blockierungspuffer mit einem spitzen Kunststoff Pasteur-Pipette oder 1000 ul Pipettenspitze und ersetzen mit 400 bis 500 & mgr; l frisch Block der Anti-PECAM1 primären Antikörper enthält 01.50 verdünnt. Drehen Sie die Rohre über Nacht bei 4 ° C.
  4. Am nächsten Tag absaugen Block / primären Antikörper mit einem feinen Spitze Pipette Plastik Pasteur oder 1000 ul Pipettenspitze und führen mindestens 6x 1 Stunde Waschungen in 1,0 ml PBST, die Röhrchen bei Raumtemperatur rotiert.
  5. Ersetzen Sie die letzte Wäsche mit frischem Blockierungspuffer das Fluorophor-konjugierten sekundären Antikörper verdünnt 1, enthaltend: 500, und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, mit einer Drehung. Vor Licht durch die Rohre in Folie wickeln.
  6. Am folgenden Tag absaugen Block / skundären Antikörper mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette und tragen mindestens 6x 1 Stunde Waschungen in 1,0 ml PBST aus, die Röhrchen bei Raumtemperatur rotiert.
  7. Lagern Sie die Herzen bei 4 ° C (lichtgeschützt) bis benötigt.

3. Herstellung von Clearing-Lösungen und Mikroskopie Geschirr

HINWEIS: Bei der Abbildung Herzen in BABB ist es wichtig, dass keine der BABB Lösung in Kontakt mit den Komponenten des Mikroskops kommt. Dazu wird das folgende Protokoll enthält Anweisungen zur Herstellung von Siliconelastomer versiegelten Geschirr geeignet für die Fluoreszenzmikroskopie, die gut vorbereitet werden kann. Das Silikon-Elastomer stellt eine Barriere die BABB enthalten und verhindern, dass es möglicherweise zwischen dem Glasboden sickert und die Polycarbonat-Seiten der Schale.

  1. Zur Herstellung der Silikonelastomer-beschichteten Schalen, nehmen optische Glasboden Kulturschalen und legen Sie eine Kappe aus einem 4 ml mit Schraubverschluss Fläschchen (ca. 1,5 cm im Durchmesser) In der Mitte jedes Gericht.
    Hinweis: Dadurch wird eine gut für die Probe bilden, wenn das Elastomer in die Schale aufgebracht wird.
  2. Füllen des Geschirrs mit Silikonelastomer bis zu einer Tiefe von etwa 0,5 cm, einen Applikator Patrone unter Verwendung der beiden Komponenten zu mischen, wie sie angewendet werden, entsprechend den Anweisungen des Herstellers. Lassen Sie für mindestens 24 Stunden aushärten, um sicherzustellen, dass die Verschlusskappe in der Mitte jeder Schale bleibt.
    HINWEIS: Eine Schutzbrille verwenden zufällige Berührung des Silikon-Elastomer mit den Augen zu vermeiden.
  3. Nachdem das Elastomer Aushärten das Fläschchen Kappe aus jeder Schale zu entfernen, wird dies eine zentrale gut verlassen, wo die Probe in direktem Kontakt gebracht werden mit dem Glasboden der Schale abgebildet werden können.
    HINWEIS: wenn sie gehärtet ist das Elastomer sollte zur Note fest und trocken sein.
  4. Bereiten Sie die BABB Lösung (1 Teil Benzylalkohol zu 2 Teilen Benzylbenzoat). Dies sollte von Licht in einer Glasflasche und geschützt aufbewahrt werden.
    ACHTUNG: BABB ist eine giftige, ätzende Lösung. Griff in einem Abzug, während geeignete Schutzkleidung tragen.
  5. (- 5 ml 1) in einem Glasfläschchen Mix BABB und Methanol 50:50 Lösung herzustellen. Vor Licht schützen, zum Beispiel durch das Fläschchen in Folie gewickelt wird .

4. Dehydration, Clearing und Montage von Herzen für konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Größere Proben können in 4 ml Glasfläschchen, jedoch für kleine Proben (zB Herz bis E13.5) gelöscht werden , ist es besser, den Clearing - Prozess durchführen direkt in der Mikroskopie Gericht. Dies hilft zu verhindern, 'verlieren', um die Proben als die Herzen sehr transparent geworden einmal gelöscht. Für diese kleinen Proben ist Clearing sehr schnell, innerhalb weniger Minuten auftreten.
Hinweis: Schützen Sie die Proben vor Licht während alle folgenden Schritte durch Umwickeln / Abdeckung Rohre und Gerichte mit Folie.

  1. Vor dem Löschen entwässern die immunhistochemisch-Herzen durch eine Methanol-Serie durch die Herzen bei Raum tempe rotierendenratur in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen in aufeinanderfolgenden Änderungen der folgenden Lösungen: 25% Methanol / 75% PBS, 50% Methanol / 50% PBS und 75% Methanol / 25% PBS (5 min in jedem). Schließlich drehen für 3 x 5 min in 100% Methanol.
  2. Für bis zu Herzen E13.5, Platz in der Mitte der Mikroskopie Schale; unter dem Mikroskop sicherzustellen, wird das Herz mit seiner Rückenseite nach oben orientiert. Entfernen Sie das Methanol aus um das Herz mit einem feinen Spitze Kunststoff Pasteurpipette.
  3. Mit einem sauberen fein kippte Kunststoff Pasteurpipette hinzufügen BABB: Methanol 50:50 Lösung in einem ausreichenden Volumen, das Herz zu tauchen (etwa 300 bis 400 & mgr; l). Da die Herzen manchmal in der Lösung umdrehen kann, prüfen Sie erneut die Orientierung, während die Herzen immer noch undurchsichtig sind. Lassen Sie in der Lösung für 5 min.
  4. Entfernen Sie die 50:50 Lösung auf eine Glasabfallflasche in der Abzugshaube und ersetzen mit BABB, wieder mit einem spitzen Kunststoff Pasteurpipette.
    HINWEIS: Ein großes Volumen ist nicht erforderlich; hinzufügen ausriziente so dass das Herz sitzt in einem Tropfen der Lösung. Das Herz sollte innerhalb von 5 min zu löschen.
  5. Für größere Herzen, deaktivieren Sie die Proben in Glasfläschchen.
    HINWEIS: Ein E15.5 Herz innerhalb von 30 min-1 Stunde löschen soll, kann aber über Nacht bei Bedarf überlassen werden.
  6. Nachdem die Probe klar ist, um die Lösung zu entfernen und mit einem minimalen Volumen BABB ersetzen. Optional umfassen die Probe mit einem Deckglas, um es an Ort und Stelle zu halten, was jedoch nicht unbedingt erforderlich ist. Verwenden Sie das Herz für die Bildgebung.

5. Imaging Gelöscht Herzen durch konfokale Mikroskopie

HINWEIS: Die Bilder wurden auf einem invertierten konfokalen Mikroskop 10X oder 20X Trockenobjektive mit erfasst. Obwohl es möglich ist, die Gerichte auf einer aufrechten konfokalen zu verwenden, muss besonders vorsichtig Kontakt des Objektivs mit der BABB Lösung zu vermeiden.

  1. Sammeln Sie ein z-Scan des Herzens 15. Je nach Größe des Herzens, kann eine Kachel - Scan das ganze Herz 16 bis Bild erforderlich.
    ACHTUNG: BABB ist eine ätzende Lösung, saubere Handschuhe tragen und sicherstellen , dass die Außenseite der Mikroskopie Schale frei von BABB ist. Behandeln Sie die Schale vorsichtig und halten Sie den Deckel auf die Schüssel das Risiko einer versehentlichen Verschütten auf das Mikroskop zu minimieren.
  2. Wenn es das Ziel Arbeitsabstand ermöglicht, verwenden Sie eine höhere Vergrößerung höher auflösende Bilder von Regionen von Interesse zu erreichen.

6. Datenanalyse mit Fidschi Software

  1. Öffnen Sie die z Stapel von Bildern in Fidschi 17.
  2. Um az Projektion des gesamten Stapels oder einen Teil davon zu machen, klicken Sie auf das Bild und wählen Sie Stapel, gefolgt von Z-Projekt. Geben Sie die Start- und Stopp - Slice - Nummern, und wählen Sie die Art der z - Projektion, zB mittlere Intensität, max Intensität.
  3. So markieren Sie einzelne Schiffe innerhalb eines Stapels von Bildscheiben für den Blow-Werkzeug (aus dem Plug-Ins-Menü wählen Sie Segmentation und dann Schlag / Lasso-Werkzeug) und klicken Sie auf die Bereiche des Bildes werden in ea gefülltch in Scheiben schneiden. Verwenden Sie den Fill-Befehl (klicken Sie auf Bearbeiten, und wählen Sie dann Fill) die ausgewählten Bereiche mit der Vordergrundfarbe zu füllen (klicken Sie auf Bearbeiten, und wählen Sie Optionen, gefolgt von Farben und Vordergrund).
  4. Z-Projekt nach wie vor das Bild stapeln.

7. 3D-Oberflächen Volume Rendering von Koronararterien generiert Imaris Verwendung

  1. Klicken Sie auf das Symbol Ansicht Surpass am oberen Rand des Bildschirms und ziehen Sie die Bilddatei in das Datenfenster. Klicken Sie auf das 3D-Ansicht-Symbol am oberen Rand des Bildschirms.
  2. Wählen Sie das Oberflächen-Symbol (blaues Symbol) und klicken Sie dann auf die Registerkarte Erstellen. Klicken Sie auf "Weiter automatische Erstellung, manuell bearbeiten" Dialogfeld und klicken Sie auf das Draw-Symbol (dünne Bleistiftsymbol).
  3. Wählen Sie die Kontur Tab und dann auf die Registerkarte Modus. Im Modus, klicken Sie auf den Zauberstab oder isoline Symbole. Wählen Sie den Zeiger-Modus in der Pointer-Auswahl auf der rechten Seite des Bildschirms, indem Sie neben "Select", und klicken Sie dann auf die "Draw9; Box (in der linken unteren Ecke des Bildschirms).
  4. Verwenden Sie die Isolinie oder Zauberstab-Werkzeug die Konturen der Arterien in den aufeinanderfolgenden Scheiben zu wählen. Navigieren Sie von Schicht zu Schicht der Scheibe Position Schieberegler.
  5. Wenn alle Konturen ausgewählt haben, klicken Sie auf das Oberflächenfeld erstellen. Die umgebende Volumen kann unsichtbar gemacht werden, oder mehr oder weniger undurchsichtig unter Verwendung der Blend-Modus wiedergegeben; Klicken Sie auf Volume um es zu markieren und dann auf die Registerkarte Einstellungen wählen, die Registerkarte Modus gefolgt. Wählen Sie Blend und den Schieberegler verwenden, um die Opazität ändern.
  6. Zum Aufzeichnen von Bildern mit der Snapshot-Funktion.

Representative Results

Da das Herz entwickelt, wird das Myokard durch Endothelzellen (ECs) aus verschiedenen Quellen eingedrungen, und ein Gefäßplexus gebildet wird. Die Schiffe, die innerhalb des Ventrikelmyokards entwickeln wird weitergehen , die Kapillare und arterielle Netzwerke zu bilden 18 mit Sauerstoff angereichertem Blut zum Herzgewebe liefern. Zur gleichen Zeit (ungefähr E11.5) der koronaren beginnen Stiele unabhängig von einem separaten Kapillarnetz zu entwickeln (als peritruncal Plexus bekannt), die das Lumen der Aorta 14,19,20 umgibt. Peritruncal plexus ECs bilden zunächst mehrere Verbindungen mit dem Lumen der Aorta auf der Höhe der Ventil Sinus, jedoch letztlich nur ein Behälter auf jeder Seite der Aorta bestehen bleiben wird, geht auf die Wurzeln der linken und rechten Koronararterien 21 bilden. Aus der ganzen peritruncal E13.5 und ventrikuläre verbinden Herzkranzgefäße ein miteinander verbundenes Netzwerk bilden nach oben, den Blutfluss aus dem ein ermöglichtorta in die Herzkranzgefäße 14,22. Färbung von ECs mit anti-PECAM-1-Antikörper, mit BABB Clearance der intakten Herzen kombiniert wird, ermöglicht die Analyse der Entwicklung von koronarer Netzwerke von den frühesten möglichen Stufen. In späteren Entwicklungsstadien der Strukturierung der Reifung Koronararterien kann auch untersucht werden. Dieses Verfahren kann auch die Vaskulatur von ganzen Embryos zu färben verwendet werden (bis E11.5 mindestens) und mit verschiedenen Antikörpern, beispielsweise Anti-alpha smooth muscle actin (Sm22α) und Endomucin.

Abbildung 1 zeigt maximale Intensität z-Projektionen eines E11,5 Herz erzeugt mit Fiji - Software. Die Tile-Funktion wurde verwendet, um mehrere Teilbilder des Herzens sammeln und nähen sie zusammen in ein vollständiges Bild; Dies ist sinnvoll, einen Überblick über die Färbung in der gesamten Probe zu geben. In diesem Stadium PECAM1 Antikörper hauptsächlich färbt die endokardialen Auskleidung des Herzens und Ausströmen vessels jedoch einige ECs können auch in der linken ventrikulären Wand (geschachtelt Bereich in 1A, vergrößert dargestellt in 1A) beobachtet werden. Darüber hinaus können die peritruncal plexus deutlich in der Wand des Ausflusstrakts (OT) (eingerahmt Region in 1B) beobachtet werden. Im letzteren Fall wird die Anzahl von Schichten in der z-Stapels verwendeten Reduktions die Projektion zu erzeugen , verbessert die Klarheit des Bildes, die Verbindungen mit dem Lumen der Aorta ermöglicht deutlicher (1B ') zu visualisierenden. In 2 kann die erhöhte Gefßsystems proximal zu der Aorta in einer E12.5 Herz beobachtet werden. Abbildung 3 zeigt die peritruncal Plexus in einem E12.5 Herz. Die 12-slice z Projektion in 3A zeigt die gesamte Plexus jedoch , da einige Gefäße ventral in das Lumen der Aorta lokalisiert sind (die auch durch anti-PECAM1 Antikörper stark verschmutzt ist), Aufteilen des z-Stack into einer Anzahl Teilstapel (3B-D) stellt mehr visuelle Informationen. Zum Beispiel zeigt der Teilstapel projiziert in 3B einen peritruncal Gefäß zur ventralen Oberfläche der Aortalumen verbindet, die nicht sichtbar in der vollen Projektion ist. Figur 4 zeigt einen Teil einer E15.5 Herzens; die Koronararterien sind in diesem Stadium (4A, 30-Slice - Projektion) deutlich sichtbar. ; In der 5-Scheibe z Projektionen in den Figuren 4B und C durch PECAM1 Färbung der Aorten - und Pulmonalklappe können auch sichtbar gemacht werden gezeigt die Zweige und Verbindungen der koronaren Capillarnetz sind auch deutlicher in diesen kleineren Teilstapel Projektionen. Manuelle Segmentierung Techniken wurden verwendet , um die Koronararterien mit Fidschi (4D) oder Imaris (4D und E) zu markieren. Die 3D-Oberflächenvolumenrendering von Koronararterien / Aortenlumens erzeugt using Imaris kann mit oder ohne die umgebende Gefäßsystem (4E und F) betrachtet werden.

Die Gefäße der ganzen Embryonen können auch PECAM1 Färbung / BABB Clearance untersucht werden. 4A und A ', zeigen z Projektionen erzeugt von dem Teilstapel von der rechten Seite (z Scheiben 11 bis 65) und die linke Seite (z slices 66-110) des Embryos sind. Vergleich der beiden Bilder zeigt, dass die Intensität des Fluoreszenzsignals nicht signifikant mit tieferes Eindringen in das Gewebe zu verringern. In 4B PECAM1 (rotes Signal) und Endomucin (grünes Signal) wurden Antikörper kombiniert , um die intersomitic Arterien (ISA) und Adern jeweils zu beschriften, eines E11.5 Embryos. 4C zeigt SM22α (rotes Signal) und PECAM1 Färbung (grünes Signal) der ISA in einem E11,5 Embryo. In 6 E11.5 Embryonengefärbt mit PECAM 1 wurden unmittelbar nach BABB Clearance (4A) oder nach einem Intervall von etwa zwei Monate (4B) abgebildet. Das Fluoreszenzsignal war immer noch stark genug, um Bild erfolgreich nach längerer Lagerung der Probe in BABB.

Abbildung 1
Abbildung 1. Immunostaining eines E11,5 Herz mit Anti-PECAM1 Antikörper (Erkannte mit Anti-Ratten - IgG konjugiert an Alexa 594). (A, B) ein 2 x 2 Fliesenbild wurde unter Verwendung des 10X - Objektiv eines invertierten konfokalen Mikroskop gesammelt. PECAM1 Antikörper färbt sowohl endokardialen und vaskuläre ECs. Vorsprünge (maximale Intensität) wurden aus 22 (A) oder 5 (B) z - Scheiben von jeweils 4 um Dicke erzeugt, Fiji - Software. A 'und B' enlargements der boxed Bereiche in A und B ein . Die Pfeile in A 'zeigen , Blutgefäße in der Ventrikelwand; in B ', zeigt die Konsole die peritruncal Plexus. OT, Ausflusstraktes; LV, linker Ventrikel, RV rechten Ventrikel. Alle Bilder sind Frontalansichten. Maßstabsbalken in A und B = 200 & mgr; m; Maßstabsbalken in A 'und B' = 100 & mgr; m. Panel - 1B 'wurde von Ivins et al angepasst. 2015 19. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. Immunostaining eines E12,5 Herz mit Anti-PECAM1 Antikörper. Tafel A zeigt az Vorsprung (maximale Intensität) eines 2x2 mit Ziegeln gedeckt Scan. Die eingerahmten Region in A gezeigt VERGRÖßENed in A '; Pfeile zeigen mehrere Blutgefäße proximal zur Aorta (Ao). LV, linker Ventrikel, RV rechten Ventrikel. Alle Bilder sind Frontalansichten. Maßstabsbalken in A = 200 & mgr; m; Maßstabsbalken in A '= 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 3
Abbildung 3. Abbildung des Peritruncal Plexus in einem E12,5 Herz. Konfokalbilder einer E12,5 Aorta (Ao) gefärbt mit anti-PECAM1 Antikörper wurden mit dem 10X-Objektiv gesammelt. Die z - Projektion (maximale Intensität) in A wurde aus 12 z Scheiben (4 & mgr; m Dicke) erzeugt; Pfeile zeigen die peritruncal Plexus Gefäße. BD Die 12 z Scheiben wurden in drei Teilstapel wie angegeben und verwendet getrennte projecti zu erzeugenons; Pfeilspitzen zeigen Verbindungen durch den peritruncal plexus zum Lumen der Aorta gebildet. Peritruncal Gefäßen lokalisiert ventral in das Lumen der Aorta sind in B und C. Alle Bilder sind Frontalansichten. Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4. Koronararterien und Kapillarplexus in einem E15.5 Herz. Die konfokale Bilder eines E15.5 Herzen gefärbt mit anti-PECAM1 Antikörper wurden mit dem 10X-Objektiv gesammelt. Panel A zeigt ein Maximum von 30 z Scheiben erzeugt z Projektionsintensität (4 & mgr; m Dicke); Pfeile zeigen die linken und rechten Koronararterien (LCA und RCA), die an der Aorta (AO) Anschluss zu sehen ist. Mit different 5 z Scheibe Unter stapelt die Aorten - und Pulmonalklappe (AoV und PV) in B bzw. C (blaue Klammern) zu sehen. Die ventrikuläre Kapillarplexus ist auch klarer in diesen kleineren Teilstapel Projektionen; Blutgefäße proximal der Pulmonalklappe (kleine Box) in der rechten unteren Ecke des Panel C (großer Kasten) vergrößert dargestellt. Fidschi wurde verwendet , um einzelne Blutgefäße zu markieren, zum Beispiel für Panel D den Schlag / Lasso - Werkzeug verwendet wurde , um die Koronararterien mit roter Farbe zu füllen manuell in jeder z Scheibe vor der Projektion. Imaris Software wurde verwendet , um 3D - Bilder der Arterien (rot) und Aorten - Lumen (grün) in E und F zu schaffen; dies wurde wieder manuell, mit dem Zauberstab-Werkzeug Objektkonturen in jeder z Scheibe zu erstellen. Die Trübung des umgebenden Volumen kann in Mischmodus geändert werden, wie in E. Alternativ kann das 3D - Bild extrahiert werden, wie in F gezeigt Ventrikel. Alle Bilder sind Frontalansichten. Maßstabsbalken in A = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5
Abbildung 5. Abbildung von Embryonic Gefäßsystem. Die Felder A und A 'zeigen konfokale Bilder eines E10.5 Wildtyp - Embryo mit anti-PECAM1 Antikörper, sammelte das 10X - Objektiv mit (Kachel - Scan). Mittlere Intensität z Projektionen wurden von z Scheiben 11-65 (A) und 66-110 (A ') eines 120 z Scheibe Scan (4 um dicke Scheiben), erzeugt nur einen geringen Verlust der Fluoreszenzintensität über die Dicke des Embryos zeigt . Tafel B zeigt die intersomitic Gefäße eines E11.5 Embryos mit Antibod gefärbt ies gegen PECAM1 (rotes Signal von 594-konjugierten sekundären Antikörper) und Endomucin (EMCN, grünes Signal von 488-konjugierten sekundären Antikörper), die die intersomitic Arterien Fleck (Pfeil) und Venen (Pfeilspitze) bzw. (mittlere Intensität z Projektion von einem gekachelten Scan). Tafel C zeigt intersomitic Arterien (ISA) von einem E11.5 Wildtyp - Embryo mit Antikörpern gegen PECAM1 (grünes Signal von 488-konjugierten sekundären Antikörper) und SM22α (rotes Signal von 594-konjugierten sekundären Antikörper) gefärbt. Die konfokale Bilder wurden unter Verwendung des 20X Trockenobjektiv gesammelt und verwendet, um maximale Intensität z Projektionen erzeugen. Alle Bilder sind sagittale Ansichten. Maßstabsbalken in A und B = 250 & mgr; m, Maßstabsbalken in C = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 6. immunogefärbten Proben in BABB Gelöscht Fluoreszenz - Signal beibehalten mindestens zwei Monate. E11.5 Embryonen wurden mit PECAM1 Antikörper und klären mit BABB gefärbt; Embryonen aus der gleichen Charge wurden sofort oder nach einem Zeitraum von zwei Monaten abgebildet. Panel A zeigt die intersomitic Arterien des Embryos abgebildet sofort und Tafel B zeigt der Embryo zwei Monate später abgebildet. Die konfokale Bilder wurden unter Verwendung des 10X Trockenobjektiv gesammelt und verwendet, um maximale Intensität z Projektionen erzeugen. dAO, dorsale Aorta. Bilder sagittale Ansichten. Maßstabsbalken in A und B = 100 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Koronargefäße in ganzen embryonalen Herzen wurden von Wholemount Immunfärbung mit Anti-PECAM1 Antikörper, gefolgt von optischen Clearance und der konfokalen Mikroskopie abgebildet. Die einfache Methode, die hier beschrieben wird, für die Freigabe der embryonalen Mäuseherzen mit BABB, erhöht die optische Durchdringung und ermöglicht die Erfassung von hochauflösenden Bildern von Blutgefäßen lokalisiert in der Aorta und Ventrikelwände. Glycerol-basierten Montage Reagenzien wie Vectashield (Brechungsindex 1,45) wurden auch für die Bildgebung der Koronargefäße 22 verwendet worden , aber die höheren Brechungsindex von BABB (1.56) noch weitere Lichtstreuung reduziert, tiefere Eindringen in das Gewebe ermöglicht. Gewebeclearance vermeidet die Notwendigkeit komplexer, teurer Formen der Mikroskopie, wie beispielsweise Multi und Lichtbogen-Mikroskopie, die weniger leicht Forschern zur Verfügung stehen. Das Clearing - Prozess ist extrem schnell im Vergleich zu anderen Methoden 6-9 und für kleine Proben ca sein kannmit kleinen Mengen an Reagenzien direkt auf der Mikroskopie Gericht rried aus. Robust Anfärbung der Vaskulatur ist erforderlich, um qualitativ hochwertige Bilder zu erzielen; anti-PECAM1 Antikörper wurde ausgewählt, da es alle Arten von koronaren ECs markiert und eine Reihe von kommerziellen Antikörper gefunden wurden, in geeigneter Weise ein hohes Maß an Färbung zu geben. Darüber hinaus scheint die Fluoreszenzfärbung in BABB äußerst stabil; Proben, die bei Raumtemperatur in BABB gespeichert (lichtgeschützt) erhalten für mehrere Monate ihre Fluoreszenzsignal. Die Tatsache, dass PECAM1 Antikörper wirksam die koronare Endokard Etiketten sowie die Vaskulatur gelegentlich problematisch war, insbesondere wenn Bilder des peritruncal plexus einzufangen. Stärkere Färbung der Aortalumens gegenüber dem peritruncal ECs ergab eine Gefahr der Übersättigung in einigen Bereichen der Bilder, was bedeutet, daß eine sorgfältige Einstellung der Abbildungsparameter erforderlich war. Idealerweise nur eine Antikörperfärbung vaskulären ECs verwendet werden würde; in der Praxis,jedoch der Suche nach geeigneten Antikörpern, die das erforderliche Maß an Färbung ergeben Wholemount kann schwierig sein. Vor kurzem Fettsäure - bindendes Protein 4 (FABP4) wurde 23 ein Marker für koronare Gefäß ECs gezeigt werden , und somit eine Alternative zu PECAM1 darstellen.

Um die 3D-Morphologie der Aorta und Herzkammern die Proben nicht flach montiert zu halten waren, wurden aber stattdessen in dem Glasbodenschalen abgebildet. Die Tiefe der Proben abgebildet werden ausgeschlossen die Verwendung hoher Vergrößerung Ziele aufgrund ihrer kurzen Arbeitsabstände. Allerdings hochauflösende Bilder waren noch erreichbar ein 10X-Objektiv mit Pixel-Verweilzeit zu erhöhen und eine Pixelanordnung Größe von mindestens 1.024 x 1.024 für die Bilderfassung verwendet wird. Dies war ausreichend für die Analyse der Struktur und Verteilung der Herzkranzgefäße können jedoch feinere Analyse der Zellstruktur erfordern Flachmontage von Proben. Dissektion der einzelnen Teile des Herzens für die Montage,Beispiel Ventrikel Wänden oder Aorta kann auch erforderlich sein. Alternativ Überabtastung des Bildes durch Entfaltungs gefolgt kann ausgeführt werden, um Auflösung und Empfindlichkeit zu erhöhen; dies erfordert jedoch wesentlich längere Scanzeiten und erzeugt eine extrem große Bilddateien, die viel Rechenleistung benötigen zu verarbeiten.

Herzen bis E15.5 wurden unter Verwendung dieses Verfahrens erfolgreich abgebildet wird, und es ist auch möglich, das Gefäßsystem von ganzen Embryonen zu analysieren (bis zu mindestens E11.5) dasselbe Protokoll verwenden. Andere Zelltypen, beispielsweise glatte Muskelzellen wurden auch in unserem Labor unter Verwendung dieser Technik abgebildet worden. Für dickere Gewebe, zum Beispiel Herz älter als E15.5, können Antikörper Penetration ein limitierender Faktor sein; längere Inkubationen und / oder erhöhte Reinigungsmittel erforderlich sein. Zusätzlich, wenn eine große z Stapel von Bildern Sammeln von Signalstärke reduziert werden kann, wie die Laser der weitesten Teile des Gewebes durchdringen; aber die confOcal Einstellungen können Laserleistung zu erhöhen, mit zunehmendem Abstand z eingestellt werden.

Dieses Verfahren erleichtert die konfokale mikroskopische Analyse von sowohl den frühesten Stadien der koronaren Gefäßbildung und der Strukturierung der Koronararterien in späteren Entwicklungsstadien wirksam. Detaillierte Informationen über die Verteilung, Verzweigung und Struktur der Blutgefäße können in kurzer Zeit erfasst werden, ist dies ein wertvolles Werkzeug für die Untersuchung der genetischen Mausmutanten mit spezifischen Defekten in Angiogenese Wege macht.

Acknowledgments

Die Arbeit wurde von der British Heart Foundation'and vom Nationalen Institut für Gesundheitsforschung Biomedical Research Centre an Great Ormond Street Hospital für Kinder NHS Foundation Trust und University College London unterstützt finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Life Technologies 14190-094
Forceps FST 11251-30
10 cm Petri dishes Falcon 351029
35 mm Petri dishes Sigma P5112
Stainless steel minutien pins 0.2 mm diameter FST 26002-20
Fine tip pastettes  Alpha Laboratories LW4061
1,000 ml pipette tips Sorenson 34000
48-well plate Falcon 353078
Kwik-Gard World Precision Instrument KWIKGARD Silicone elastomer Sylgard184 packaged in a cartridge for mixing and dispensing
Kwik-Gard refill World Precision Instrument KWIKGLUE Refill cartridges and dispensing tips
Paraformaldehyde Sigma P6148 Make up in PBS and store at -20 °C
100% methanol VWR 20847307
Tween®20 Sigma P1379
Goat serum Sigma G9023
Anti-PECAM1 antibody, rat anti-mouse BD Pharmingen 553370 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31 polyclonal, rabbit polyclonal Abcam ab28364 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-CD31/PECAM1 clone 2H8, armenian hamster monoclonal Thermo Fisher Scientific MA3105 Primary antibody, dilute 1 in 400
Endomucin antibody (V.7C7), rat monoclonal Santa Cruz Biotechnology sc-65495 Primary antibody, dilute 1 in 50
Anti-SM22 alpha antibody, rabbit polyclonal Abcam ab14106 Primary antibody, dilute 1 in 250
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific A11007 Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-rabbit IgG (H+L)Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific Secondary antibody, dilute 1 in 500
Goat anti-Armenian Hamster IgG (H+L)Alexa Fluor 488 Abcam ab173003
Goat anti-rat IgG (H+L)Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A21208 Secondary antibody, dilute 1 in 500
Phenolic screw cap Wheaton 240408
Benzyl alcohol Sigma 402834
Benzyl benzoate Sigma B6630
Imaris Bitplane Imaging image analysis software
ImageJ software NIH Freeware

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References

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Die Analyse der Herzkranzgefäße in Gelöscht Embryonale Herz
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Ivins, S., Roberts, C., Vernay, B., Scambler, P. J. Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts. J. Vis. Exp. (118), e54800, doi:10.3791/54800 (2016).More

Ivins, S., Roberts, C., Vernay, B., Scambler, P. J. Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts. J. Vis. Exp. (118), e54800, doi:10.3791/54800 (2016).

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