Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Slagtilfælde under den neonatale periode er en væsentlig årsag til død og invaliditet, der forekommer i så mange som 1 i 2300 levendefødte 1. Dette fører til ændret udvikling af centralnervesystemet og øget langsigtet sygelighed, herunder øget forekomst af epilepsi, cerebral parese, mental retardering, og andre typer af motor eller kognitiv dysfunktion. De livslange virkninger af tidlig slagtilfælde gøre translationelle dyremodeller afgørende for behandlingen mekanismerne i skade og reparation i denne population, herunder strategier for at beskytte den skadede hjerne eller at forbedre reparation.
Forskellige iskæmimodeller er blevet anvendt til at undersøge hjerneskade hos voksne dyr, og mens Rice-Vannucci (Modified Levine) 2 procedure er almindeligt anvendt til at studere hypoxisk-iskæmisk skade i udviklende hjerne, fokal iskæmi-reperfusion er en særskilt mekanisme skade forårsager fokal skade, med en skadet kerne og penumbra og uskadt remote væv. De Koizumi 3 og Longa 4 modeller blev udviklet i voksne rotter for at opnå forbigående mellem-cerebral arterieokklusion via den fælles carotidarterie (CCA) og ydre carotidarterie (ECA), hhv. I begge modeller, permanent ligation og ætsninger af arterie grene er vigtigt at minimere blødning og at strømline den kirurgiske procedure, som også forårsager bivirkninger på dyrets evne til at fodre og at tage på i vægt efter skade. Desuden er der distinkte skade mekanismer i umodne hjerne og specifikke mønstre af skade ses som et resultat.
For nylig er photothrombotic slagtilfælde (Rose-Bengal metode) 5 og permanent MCA ligering 6 blevet anvendt til at undersøge neonatale og voksne slagtilfælde. Både photothrombotic slagtilfælde og MCA ligation skabe permanente ændringer i cerebral blodgennemstrømning, der resulterer i en mangel på reperfusion. Reperfusion er en kritisk komponent i udviklingen og progressionen af fokal skade, med øget excitotoksicitet, dannelse af frie radikaler, og nitrogenoxidproduktion fører til forsinket celledød, der involverer signalering kaskader, der er forskellige fra den iskæmiske fase 7. Hypoxi-iskæmi involverer permanent unilateral carotid ligering efterfulgt af global hypoxi, som adskiller sig også fra årsagen til hypoxisk-iskæmisk skade hos mennesker og forårsager ikke en ensartet fokal skade mønster, hvilket gør undersøgelse af den skadede kerne og Penumbra mere udfordrende.
Vi har tidligere beskrevet en ikke-hæmorrhagisk iskæmireperfusion slagtilfælde model i umodne rotter under anvendelse af forbigående mellem-cerebral arterieokklusion (MCAO) 8, 9, 10. Dette er en mindre invasiv metode, der får adgang og lukker MCA gennem den interne halspulsåre uden permanent ligatipå eller ætsninger. Dette tilvejebringer en model for skade ligner den mest almindelige årsag til slagtilfælde i den perinatale periode 11, 12. Denne iskæmireperfusion model af skade resulterer i beskadigelse af ipsilaterale striatum og parieto-temporale cortex. Denne model af tMCAO tillader også kontrol over alvorligheden af kvæstelser ved at variere varigheden af okklusion. Undersøgelse af signalveje og histologiske forandringer i den skadede kerne og Penumbra og i den ikke skadede ipsilaterale og kontralaterale væv kan yderligere belyse de mekanismer skade og reparation i umoden hjerne. Denne undersøgelse vil demonstrere denne vigtige skade model for udvikling af hjernen.
Kritiske trin i protokollen
For det første er det vigtigt at opretholde normotermi fra initieringen af anæstesi indtil fuldstændig genvinding, som der er kendte effekter af både hypotermi 17 og hypertermi 18 på progression af hjerneskade i både umodne og modne dyr. Sekund, mens der sikres dyret og tilbagetrækning af indsnit, optimal positionering for at overvåge åndedræt og sikre, at luftrøret er fri for kompression er afgørende. Tredje, undgå klemning eller strække vagusnerven, da dette kan forårsage ændringer i hjertefrekvens med vagal stimulering. For det fjerde, fordi tilbagetrækning af ICA er nødvendig for at kontrollere blødning under arteriotomien, skal man være opmærksom på graden af spænding under tilbagetrækning for at undgå at beskadige arterie. Hvis arterien går i stykker fra tilbagetrækning, eller hvis der er en dårlig arteriotomi snit, dyret skal udelukkes fra analysen på grund af risikoenaf blødning og dårlig reperfusion.
Ændringer og fejlfinding
Anvendelse af MRI som en guide, kan suturen længde optimeres for at sikre, at silikone spids korrekt okkluderer MCA at skabe den fokal iskæmi. Hvis MR ikke er til rådighed, kan hvalpene aflives før reperfusion til dissektion at visualisere placeringen af sutur. Juster suturen længde efter behov. Den fødselsvægt stærkt korrelerer med kravene til okkluderende sutur længde. Occlusionstiden kan modificeres til at justere graden af skade sværhedsgrad.
Desuden sutur form og længde er kritiske. For P10 Sprague-Dawley og Long Evans hanrotter, der vejer 19-21 g, 10 mm er den optimale længde af insertion i vores erfaringer. Yderligere indføring af den okkluderende sutur kan resultere i perforering af MCA. Endvidere vil konsistensen i form af glødetråden okkluderende i hver kirurgi resultere i en forøget konsistens skade pattern 19, 20. Derfor anbefales det at bruge professionelt fremstillede suturer til dette specifikke formål. Det er også vigtigt at bemærke, at skaden mønster kan variere mellem praktikere på grund af tilsyneladende små forskelle i teknik.
Begrænsninger af teknikken
Udførelse af denne teknik i en lille, udvikling gnaver kræver betydelig erfaring. Hvis udføres korrekt, kirurgen er i stand til at forårsage en meget konsekvent skade mønster tværs dyr af forskellig størrelse og nå en overlevelsesrate på mere end 95%. Desuden ordentlig kirurgiske værktøjer er afgørende. Kirurgiske instrumenter skal være godt vedligeholdt for at sikre, at alle instrumenter tips tilnærme ordentligt.
Betydningen af denne teknik i forhold til eksisterende eller alternative metoder
Mens hypoxi-iskæmi, eller Rice-Vannucci model 2 </sup>, er mest almindeligt anvendt til at studere hypoxisk-iskæmisk skade i udviklende hjerne, er det vigtigt at bemærke, at denne model af tMCAO adskiller sig fra HI i, at der er transient fokal iskæmi uden global hypoxi, efterfulgt af en reperfusion fase, hvor obstruktion fjernes, og blodgennemstrømningen er genoprettet. Dette bevirker en mere konsekvent og reproducerbar skade og er mere klinisk translatorisk ved at forårsage en skade svarende til mønsteret set i fuldbårne neonatal slagtilfælde. Dette gør det muligt studiet af fokale skademønstre og kompenserende reaktioner i uskadt væv.
Fremtidige applikationer efter mastering denne teknik
Denne model ligner den mest almindelige årsag til slagtilfælde i menneskelige nyfødte, en forbigående okklusiv trombe, der forekommer i den perinatale periode 11, 21. Ætiologien er ikke helt klar og er mest sandsynligt multifaktoriel, men det antages i de fleste tilfælde to skyldes emboli passerer fra moderkagen 11. Desuden er mange nyfødte med formodet perinatal slagtilfælde ofte til stede med senere anfaldsaktivitet eller subtile fokal neurologisk undersøgelse abnormaliteter 22. Dette gør anvendelsen af en konsekvent, translationel skade model til identifikation mekanismer skade progression og mulige terapeutiske strategier afgørende.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |