Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Beroerte tijdens de neonatale periode is een belangrijke oorzaak van overlijden en invaliditeit, die zich in maar liefst 1 op de 2300 levendgeborenen 1. Dit leidt tot een veranderde centrale ontwikkeling van het zenuwstelsel en verhoogde morbiditeit op lange termijn, met inbegrip van verhoogde incidentie van epilepsie, hersenverlamming, mentale retardatie, en andere vormen van motorische of cognitieve stoornissen. De levenslange gevolgen van de vroege slag maken translationele diermodellen van essentieel belang voor de behandeling van de mechanismen van de schade en reparatie in deze populatie, met inbegrip van strategieën om de gewonde hersenen te beschermen of om de reparatie te verbeteren.
Verschillende ischemie modellen zijn gebruikt om hersenletsel bij volwassen dieren bestuderen, en terwijl de rijst-Vannucci (Modified Levine) procedure 2 wordt gewoonlijk gebruikt hypoxisch-ischemisch letsel in de zich ontwikkelende hersenen bestuderen focale ischemie-reperfusie een goede letselmechanisme waardoor focale verwonding, een gewonde kern en penuMBRA en uninjured remote weefsel. De Koizumi 3 en 4 Longa zijn uitgewerkt bij volwassen ratten tijdelijke midden-cerebrale slagaderocclusie bereiken via de carotis communis (CCA) en uitwendige halsslagader (ECA), respectievelijk. In beide modellen, permanente ligatie en cauterisatie van slagader takken zijn belangrijk om het bloeden te minimaliseren en om de chirurgische procedure, die ook schadelijke effecten heeft op het vermogen van het dier te voeden en om gewicht na letsel krijgen stroomlijnen. Verder zijn er verschillende mechanismen schade in de onrijpe hersenen en specifieke patronen schade gezien als resultaat.
Meer recent zijn fototrombotisch beroerte (Rose-Bengal methode) 5 en permanente MCA ligatie 6 is gebruikt om te studeren neonatale en volwassen beroerte. Zowel fototrombotisch beroerte en MCA ligatie creëren permanente veranderingen in cerebrale bloeddoorstroming die resulteren in een gebrek aan reperfusion. Reperfusie is een essentieel onderdeel van de ontwikkeling en progressie van focale verwonding, met verhoogde excitotoxiciteit, vorming van vrije radicalen en stikstofoxide leidt tot vertraagde celdood die inhoudt signalerende cascades die verschilt van de ischemische fase 7 zijn. Hypoxie-ischemie behelst permanent eenzijdige carotis ligatie gevolgd door globale hypoxie, die ook verschilt van de oorzaak van hypoxisch-ischemisch letsel bij mensen en niet consistent focale patroon van verwondingen veroorzaken, waardoor studie van de verwonde kern en penumbra moeilijker.
We hebben eerder beschreven niet-hemorragische ischemie-reperfusie beroertemodel in de onrijpe ratten middels tijdelijke midden-cerebrale slagaderocclusie (MCAO) 8, 9, 10. Dit is een minder invasieve methode die toegang afsluit en de MCA via de carotis interna zonder blijvende ligatiof cauterisatie. Dit verschaft een model van verwonding vergelijkbaar met de meest voorkomende oorzaak van een beroerte in de perinatale periode 11, 12. Deze ischemie-reperfusie model van het letsel leidt tot schade aan de ipsilaterale striatum en parieto-temporale cortex. Dit model maakt het ook tMCAO controle over de ernst van de schade die variëren van de duur van de occlusie. Onderzoek van signaalroutes en histologische veranderingen in de verwonde kern en penumbra en in de niet-beschadigde ipsilaterale en contralaterale weefsel kan het mechanisme van verwonding en herstel verder te ontrafelen in de onrijpe hersenen. Deze studie zal dit belangrijke letsel model voor de ontwikkeling van de hersenen aan te tonen.
Kritische stappen in het protocol
Ten eerste is het belangrijk om normothermia vanaf het begin van de anesthesie te handhaven tot volledig herstel, want er zijn bekend bij zowel hypothermie 17 en hyperthermie 18 op de progressie van hersenletsel bij zowel onvolwassen en volwassen dieren. Ten tweede, terwijl daarnaast het dier en het terugtrekken van de insnijding optimale positionering ademhaling volgen en ervoor te zorgen dat de luchtpijp vrij compressie essentieel. Ten derde, vermijd knijpen of strekken van de nervus vagus, omdat deze veranderingen in de hartslag met vagale stimulatie kan veroorzaken. Ten vierde, omdat het terugtrekken van de ICA nodig is om het bloeden onder controle tijdens de slagaderincisie, aandacht moet worden tijdens het terugtrekken besteed aan de mate van spanning om te voorkomen dat schade aan de slagader. Als de slagader scheurt uit terugtrekken, of als er een slechte slagaderincisie incisie, het dier moet worden uitgesloten van de analyse vanwege het risicobloeding en slechte reperfusie.
Wijzigingen en het oplossen van problemen
MRI gebruikt als richtlijn kan de hechtdraad lengte worden geoptimaliseerd opdat de siliconen tip goed afsluit MCA de focale ischemie maken. Als MRI niet beschikbaar is, kan pups worden gedood voordat reperfusie voor dissectie om de plaatsing van de hechtdraad te visualiseren. Pas de hechting benodigde lengte. De jonggewicht sterk correleert met de afsluitende sutuur lengtevereisten. De occlusie tijd kan worden aangepast aan de mate van ernst van de verwonding aan te passen.
Bovendien hechtdraad vorm en lengte kritisch. Voor P10 Sprague-Dawley en Long Evans ratten met een gewicht 19-21 g, 10 mm is de optimale lengte van insertie in onze ervaring. Het verder insteken van de afsluitende sutuur kan leiden tot perforatie van het MCA. Bovendien zal de consistentie in de vorm van het afsluitende filament per operatie resulteren in een toegenomen consistentie van letsel pattern 19, 20. Om deze reden raden we het gebruik van professioneel vervaardigde hechtingen voor dit specifieke doel. Het is ook belangrijk om op te merken dat de schade patroon kan verschillen tussen de beoefenaars als gevolg van schijnbaar minieme verschillen in techniek.
Beperkingen van de techniek
Het uitvoeren van deze techniek in een klein, het ontwikkelen van knaagdier vereist aanzienlijke ervaring. Indien correct uitgevoerd, de chirurg is in staat om een zeer consistent patroon van verwondingen aan de overkant van dieren van verschillende grootte veroorzaken en het bereiken van een overlevingspercentage van meer dan 95%. Bovendien, een goede chirurgische instrumenten zijn van essentieel belang. Chirurgische instrumenten moeten goed worden onderhouden om ervoor te zorgen dat alle instrument tips goed te benaderen.
Betekenis van deze techniek met betrekking tot bestaande of alternatieve methoden
Hoewel hypoxie-ischemie, of de Rice-Vannucci model 2 </sup>, wordt het meest gebruikt om hypoxisch-ischemische schade in de ontwikkeling van de hersenen te bestuderen, is het belangrijk om op te merken dat dit model van tMCAO verschilt van HI in dat er sprake is van voorbijgaande focale ischemie zonder globale hypoxie, gevolgd door een reperfusie fase waarin de obstructie wordt verwijderd en de bloedstroom wordt hersteld. Dit veroorzaakt een meer consistente en reproduceerbare letsel en is klinisch translationeel door letsel tot gevolg patroon vergelijkbaar met dat waargenomen bij voldragen pasgeborenen beroerte. Dit maakt de studie van focale letselpatronen en compenserende responsen in niet-verwonde weefsel.
Toekomstige toepassingen na het beheersen van deze techniek
Dit model lijkt op de meest voorkomende oorzaak van een beroerte in humane pasgeborenen, een tijdelijke occlusieve trombus die tijdens de perinatale periode 11, 21. De etiologie is niet geheel duidelijk en is het meest waarschijnlijk multifactoriële, maar aangenomen wordt in de meeste gevallen to resultaat van emboli passeren van de placenta 11. Daarnaast zijn veel pasgeborenen met veronderstelde perinatale beroerte vaak aanwezig bij latere toevallen of subtiele focale neurologische afwijkingen examen 22. Dit maakt het gebruik van een consistente, translationeel letsel model om mechanismen van letsel progressie en mogelijke therapeutische strategieën cruciaal te identificeren.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |