Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
שבץ בתקופת הילוד הנו גורם משמעותי של מוות ונכות, המתרחשים רבים ככל 1 ב 2300 לידות חיות 1. זה מוביל להתפתחות מערכת העצבים המרכזית שינו מוגברת לתחלואה ארוכת טווח, כולל שכיחות מוגברת של אפילפסיה,, פיגור שכלי שיתוק מוחין, וסוגים אחרים של המנוע או תפקוד קוגניטיבי. ההשפעות לכל החיים של שבץ מוקדם לעשות במודלים של בעלי חיים translational חיוני לבחינת מנגנונים של פגיעה ותיקון באוכלוסיה זו, כולל אסטרטגיות כדי להגן על המוח נפגע או לשפר תיקון.
מודלים איסכמיה שונים שימשו ללמוד פגיעה מוחית אצל בעלי חיים בוגרים, ובעוד רייס-מוואנוצ'י (Modified לוין) 2 הליך נפוץ ללמוד פגיעה איסכמית-היפוקסי במוח המתפתח, מוקד איסכמיה-רה-פרפוזיה הוא מנגנון מובהק של פגיעה גרימת חבלה המוקד, עם הליבה penu פצועmbra ורקמות מרחוק וללא כל פגע. קואיזומי 3 ו Longa 4 הדגמים שפותחו חולדות מבוגרות להשיג חסימה של עורק המוח אמצעי חולפת דרך עורק התרדמה המשותפת (CCA) ו עורק תרדמה חיצונית (ECA), בהתאמה. בשני המודלים, קשירת צריבה קבועה של ענפי עורק חשובים כדי למזער דימום וכדי לייעל את ההליך הכירורגי, אשר גורם גם השפעות שליליות על יכולת הבהמה להאכיל לעלות במשקל בעקבות פציעה. יתר על כן, ישנם מנגנונים פגיעים ברורים במוח בשלה ודפוסים ספציפיים של פגיעה לראות תוצאה.
לאחרונה, שבץ photothrombotic (שיטת רוז-בנגל) 5 ו 6 MCA קשירת קבע שימשו ללמוד שבץ ילודים הבוגרת. שניהם שבץ photothrombotic קשירת MCA ליצור שינויים של קבע זרימת דם במוח שגורמים לחוסר reperfusיוֹן. Reperfusion הוא מרכיב קריטי של ההתפתחות וההתקדמות של פציעת מוקד, עם יתר רעיל מוגבר, היווצרות רדיקלים חופשית, וייצור Nitric Oxide המוביל למות תא מושהה המערבת איתות מפלי נבדלות השלב איסכמי 7. היפוקסיה-איסכמיה כרוך קשירת ראש חד-צדדי קבועה ואחריו היפוקסיה העולמי, אשר גם נבדל סיבת פציעת איסכמי-היפוקסי בבני אדם ואינו גורם דפוס פציעת מוקד עקבי, מה שהופך לימוד הליבה פנומברה הפצועה יותר מאתגר.
תיארנו בעבר מודל שבץ המורגי הלא-איסכמיה-רה-פרפוזיה בחולדה בשלה באמצעות חסימת עורק המוח האמצעי חולף (MCAO) 8, 9, 10. זוהי שיטה פולשנית פחות ניגשת ו חוסמת את MCA דרך עורק התרדמה הפנימי בלי ligati קבעאו צריבה. זה מספק מודל של פציעה דומה הגורם השכיח ביותר של שבץ בתקופה הסב-לידתית 11, 12. מודל איסכמיה-רה-פרפוזיה זה של תוצאות פציעה נזק בסטריאטום ipsilateral ואת קליפת הזמני-parieto. גם מודל זה של tMCAO מאפשר שליטה על חומרת הפציעה על ידי שינוי משך ספיגה. בחינת מסלולי איתות ושינויים היסטולוגית בליבת פנומברה הפגועה ברקמת ipsilateral ו נגדית וללא כל הפגע יכולה יותר להבהיר את המנגנונים של פגיעה ותיקון במוח בשלה. מחקר זה ידגים מודל פציעה חשוב זה עבור המוח המתפתח.
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול
ראשית, חשוב לשמור על טמפרטורה נורמלית מן חניכה של הרדמה עד להחלמה מלאה, כפי שיש ידועים ההשפעות של שני היפותרמיה 17 ו היפרתרמיה 18 על התקדמות של פגיעה מוחית הן חיות בשלה ובוגרת. שנית, תוך הבטחת החיה שמבטלת את החתך, מיצוב אופטימלית לניטור נשימה ועל מנת להבטיח כי קנה הנשימה היא ללא דחיסה חיוני. שלישית, למנוע סחיטה או מתיחת העצב התועה, מכיוון שהדבר עלול לגרום לשינויים בקצב לב עם גירוי מחנק. רביעית, משום הכחשה של ICA יש צורך לשלוט דימום במהלך arteriotomy, יש לשים לב למידת המתח במהלך הכחשה כדי למנוע פגיעה בעורק. אם עורק אין לקרוע מן ההכחשה, או אם יש חתך arteriotomy עני, החיה צריכה להיות מחוץ ניתוח בשל הסיכוןשל דימום ו reperfusion העני.
שינויים ופתרון בעיות
באמצעות MRI כמדריך, אורך התפר עשוי להיות מותאם על מנת להבטיח כי קצה סיליקון כמו שצריך לחסום כאן את MCA כדי ליצור את איסכמיה המוקד. אם MRI אינו זמין, גורים עלולים להיות מורדמים לפני reperfusion לנתיחה כדי להמחיש את המיקום של התפר. התאם את אורך התפר לפי צורך. משקל גור וקושר מאוד עם דרישות אורך תפר גורם לחסימה. שעת החסימה יכולה להיות שונה כדי להתאים את מידת חומרת פציעה.
בנוסף, צורת תפר ואורך הם קריטיות. עבור P10 ספראג-Dawley וחולדות לונג אוונס במשקל 19-21 גרם, 10 מ"מ הוא אורך אופטימלי של החדרת מניסיוננו. החדרת יתר של תפר occluding עלולה לגרום ניקוב של MCA. יתר על כן, העקביות בצורת הנימה הגורם לחסימה בכל ניתוח תגרום עקביות מוגברת של פגיעת pattern 19, 20. מסיבה זו, המלצנו באמצעות תפרים מתוצרת מקצועית למטרה ספציפית זו. כמו כן, חשוב לציין כי דפוס הפציעה עשוי להיות שונה בין מתרגל עקב הבדלים דקים לכאורה טכניקה.
מגבלות הטכניקה
ביצוע הטכניקה הזו מכרסם קטן, פיתוח דורש ניסיון משמעותי. אם מבוצע כהלכה, המנתח הוא מסוגל לגרום דפוס פציעה מאוד עקבי על פני בעלי חיים בגדלים שונים ולהשיג שיעור הישרדות יותר מ 95%. יתר על כן, כלי כירורגיים מתאימים קריטיים. חייבים להיות מטופח מכשירים כירורגי כדי להבטיח כי כל טיפי המכשיר משוערים כראוי.
משמעות של טכניקה זו ביחס לשיטות קיימות או חלופה
בעוד-איסכמיה היפוקסיה, או המודל רייס-מוואנוצ'י 2 </sup>, הוא נפוץ ביותר ללמוד פגיעה איסכמית-היפוקסי במוח המתפתח, חשוב לציין כי מודל זה של tMCAO הוא נבדל HI בכך שיש איסכמיה מוקד החולפת בלי היפוקסיה עולמי, ואחריו שלב reperfusion כאשר חסימת מוסר זרימת דם משוחזרת. זה גורם לפגיעה יותר עקבית לשחזור והוא יותר קליני translational ידי גרימת דפוס פציעה דומה לזו שנצפתה ב שבץ בילוד מלא טווח. זה מאפשר הלימוד של דפוסי פגיעת מוקד ותגובות מפצות ברקמה וללא כל פגע.
יישומים עתידיים לאחר מאסטרינג טכניקה זו
מודל זה דומה הגורם השכיח ביותר של שבץ בילודים אנושיים, פקיק occlusive חולף המתרחש במהלך התקופה הסבה-לידתית 11, 21. האטיולוגיה אינה ברורה לחלוטין תלויה בכמה גורמים ככל הנראה, אך ההנחה היא שברוב המקרים לאo לנבוע תסחיפים עוברים מן השליה 11. בנוסף, תינוקות רבים עם שבץ סביב לידה משוערת קרובה בהווה עם פעילות התקפים מאוחר או בדיקות נוירולוגיות מוקד עדינות מומי 22. זה הופך את השימוש במודל פציעה עקבי, translational לזהות מנגנונים של התקדמות פגיעה ואסטרטגיות טיפוליות אפשריות מכריעות.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |