Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
新生児期間中の脳卒中は、できるだけ多く2300で1として出生1で発生し、死亡および障害の重要な原因です。これは、変更された中枢神経系の発達につながり、てんかんの発生率の増加、脳性麻痺、精神遅滞、およびモータや認知機能障害の他のタイプを含む、長期罹患率を増加させました。早期の脳卒中の生涯効果は負傷者の脳を保護するために、または修理を強化するための戦略を含めて、この集団に損傷および修復のメカニズムを調べるための翻訳動物モデルが不可欠にします。
別の虚血モデルは、成体動物で脳損傷を研究するために使用されている、と米・バンヌッチ(修正レヴァイン)2手順は、一般的に脳の発達に低酸素性虚血性傷害を研究するために使用されている間、局所虚血-再灌流傷害の明確なメカニズムであります負傷したコアとpenuで、局所損傷の原因となりますmbraと無傷リモート組織。小泉3とロンガ4モデルはそれぞれ、総頸動脈(CCA)と外頚動脈(ECA)を経由して中大脳動脈閉塞を達成するために成体ラットに開発されました。両方のモデルでは、動脈枝の永久結紮および焼灼は、出血を最小限に抑え、また、損傷後の餌にすると重量を得るために、動物の能力に悪影響を引き起こし、外科的処置を、合理化することが重要です。また、未成熟脳における異なる損傷メカニズムと結果として見られる損傷の特定のパターンがあります。
さらに最近では、光血栓脳卒中(ローズ・ベンガル法)5と永久MCA結紮6は、新生児と成人のストロークを研究するために使用されています。光血栓脳卒中やMCAライゲーションの両方がreperfusの欠如につながる脳の血流の永続的な変更を作成しますイオン。再灌流が増加興奮毒性、フリーラジカル形成、及び虚血位相7は異なるシグナル伝達カスケードを伴う遅延細胞死をもたらす一酸化窒素産生と、焦点傷害の発症および進行の重要な成分です。低酸素性虚血はまた、ヒトにおける低酸素性虚血性傷害の原因とは異なり、怪我をコアと半影の研究はより困難作り、一貫性のある局所損傷パターンが発生することはありませんグローバル低酸素状態が続く永久一方的な頸動脈結紮を伴います。
我々は以前に中大脳動脈閉塞(MCAO)8、9、10を使用して未熟ラットにおける非出血性虚血再灌流脳卒中モデルを説明してきました。これは、アクセスして永久ligatiずに内頸動脈を介してMCAを閉塞低侵襲性の方法であります上または焼灼。これは、周産期11、12における脳卒中の最も一般的な原因に似た傷害のモデルを提供します。同側線条体と頭頂側頭皮質への損傷で傷害の結果のこの虚血再灌流モデル。 tMCAOのこのモデルはまた、閉塞の継続時間を変化させることにより、損傷の重症度を制御できます。シグナル伝達経路と、負傷したコアと半影中および無傷の同側および対側の組織における組織学的変化の検討がさらに未熟な脳に損傷および修復のメカニズムを解明することができます。この研究は、脳の発達のために、この重要な損傷モデルのデモンストレーションを行います。
プロトコル内の重要なステップ
両方の未熟および成熟動物における脳損傷の進行の両方に低体温17と温熱療法18の効果が知られているように、まず、完全に回復するまで、麻酔の開始から正常体温を維持することが重要です。動物を確保し、呼吸を監視し、気管が圧迫の自由であることを保証するために切開を、最適な位置を後退させながら、第二に、必要不可欠です。これは、迷走神経刺激による心拍数の変化を引き起こす可能性として第三に、迷走神経を圧迫やストレッチを避けます。 ICAの後退は、動脈切開時の出血を制御する必要があるため、第四に、注意が動脈の損傷を防ぐために、後退時の緊張の度合いに支払わなければなりません。動脈が後退から涙なければ貧しい動脈切開がある場合、または、動物によるリスクに分析から除外されなければなりません出血と貧しい再灌流の。
修正およびトラブルシューティング
ガイドとしてMRIを使用して、縫合糸の長さは、シリコーンチップが正しく局所虚血を作成するために、MCAを閉塞することを確実にするために最適化されてもよいです。 MRIが利用できない場合、切開は、縫合糸の配置を視覚化するために、子犬は、再灌流の前に安楽死させても良いです。必要に応じて縫合糸の長さを調整します。子犬の重量は非常に閉塞縫合糸長さの要件と相関します。閉塞時間は、傷害の重症度の程度を調整するように変更することができます。
加えて、縫合糸の形状及び長さが重要です。 19〜21グラムの重量を量るP10スプラーグ – ドーリーロングエバンスラットの場合は、10ミリメートルは私たちの経験では、挿入の最適な長さです。閉塞縫合糸の更なる挿入は、MCAの穿孔をもたらし得ます。また、各手術における閉塞フィラメントの形状の一貫性は、損傷pの増加一貫性をもたらすであろうattern 19、20。このような理由から、我々は、この特定の目的のために専門的に製縫合糸を使用してお勧めします。傷害パターンは技術では、一見分違いによる実務家の間で異なる可能性があることに注意することも重要です。
技術の制限事項
小さな、開発げっ歯類ではこの手法を実行すると、豊富な経験が必要です。正しく実行した場合、外科医は、異なるサイズの動物間で非常に一貫性の傷害パターンを引き起こし、95%を上回る生存率を達成することができます。さらに、適切な外科的ツールが不可欠です。手術器具はよく、すべての楽器のヒントが正常に近づくことを保証するために維持しなければなりません。
既存または代替方法に関して、この技術の意義
低酸素虚血、またはライス・バンヌッチモデルながら2 </SUP>、最も一般的に脳の発達に低酸素性虚血性傷害を研究するために使用される再灌流相に続いて世界的な低酸素のない過渡焦点虚血があるという点で、tMCAOのこのモデルはHIと区別されることに注意することが重要です障害物が除去され、血流が回復されます。これは、より一貫性と再現性の傷害を引き起こし、満期新生児脳卒中で見られるのと同様の損傷パターンを引き起こすことによって、より臨床的な翻訳です。これは、局所損傷パターンや損傷していない組織の代償反応の研究を可能にします。
この技術を習得した後、将来のアプリケーション
このモデルは、人間の新生児における脳卒中の最も一般的な原因、周産期11、21の間に発生する過渡的な閉塞性血栓に似ています。病因は完全には明らかではないが、最も可能性の高い多因子であるが、それはほとんどの場合、トンで推定されますO胎盤11から渡さ塞栓に起因します。後に発作活動や微妙な焦点神経学的検査値異常22としばしば存在すると推測周産期脳卒中また、多くの新生児。これは、傷害の進行および重要な可能な治療戦略のメカニズムを識別するために、一貫性のある、翻訳損傷モデルを使用しています。
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |