Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
신생아 기간 동안 스트로크만큼 2300의 1과 출산 (1)에서 발생하는 사망과 장애의 중요한 원인이다. 이 변형 된 중앙 신경 시스템 개발에 이르게과 간질의 발생률이 증가, 뇌성 마비, 정신 지체, 모터 또는인지 기능 장애의 다른 유형을 포함하여 장기 사망률을 증가. 초기 뇌졸중의 평생 효과는이 인구에 손상 및 수리의 메커니즘을 검사 손상된 뇌를 보호하기 위해 또는 수리를 강화하는 전략을 포함한 번역 동물 모델이 중요합니다.
다른 허혈 모델은 성인 동물에서 뇌 손상을 연구하는 데 사용하고있다이 과정은 일반적으로 개발 뇌의 저산소증 – 허혈 손상을 연구하는 데 사용되는 쌀-Vannucci (수정 레빈), 국소 허혈 – 재관류 손상의 독특한 메커니즘을하는 동안 부상 코어 및 penu에 초점 부상을 입을mbra 및 손상되지 않은 원격 조직. 고이즈미 3 및 4 롱가 모델은 각각 총 경동맥 (CCA) 및 외부 경동맥 (ECA)을 통하여 일시적 중간 대뇌 동맥 폐쇄를 달성 성인 쥐에서 개발되었다. 두 모델 모두에서 영구 결찰 및 동맥 가지의 소작은 출혈을 최소화하고 또한 동물의 능력을 공급하고 손상 후 체중이 증가하기에 부작용을 일으키는 원인이되는 수술 절차를 간소화하는 것이 중요하다. 또한, 미성숙 한 뇌에 뚜렷한 손상 메커니즘과 그 결과로 볼 부상의 특정 패턴이있다.
최근 photothrombotic 스트로크 (로즈 벵골 방법) 5 영구 MCA의 결찰 (6) 신생아 및 성인 뇌졸중을 연구하는 데 사용되었습니다. 두 photothrombotic 뇌졸중 및 MCA 내고는 reperfus의 부족을 초래할 뇌 혈류에 영구적 인 변화를 만들이온. 재관류가 증가 흥분 독성 (excitotoxicity), 자유 라디칼 형성하고, 허혈성 단계 7 구별되는 폭포 신호 포함 지연 세포 죽음에 이르는 산화 질소의 생산에 초점 부상의 발생과 진행의 중요한 구성 요소입니다. 저산소증 – 허혈은 또한 부상 코어와 더 도전 주변부의 연구를하고, 인간의 저산소 – 허혈 손상의 원인이 다릅니다과 일관된 초점 부상 패턴을 발생하지 않습니다 글로벌 저산소증, 다음에 영구 일방적 경동맥 결찰을 포함한다.
우리는 이전에 일시적 중간대 뇌동맥 폐색 (MCAO) 8, 9, 10을 사용하여 미성숙 한 쥐에서 비 출혈 허혈 – 재관류 뇌졸중 모델을 설명했다. 이것은 액세스 및 영구 ligati없이 내부 경동맥을 통해 MCA 폐색 덜 침습적 인또는 소작. 이는 주 산기 (11), (12) 뇌졸중의 가장 흔한 원인과 비슷한 부상의 모델을 제공한다. 동측 선조체 (striatum)와 두정 시간 피질에 손상 부상 결과이 허혈 – 재관류 모델. 결과 tMCAO의이 모델은 또한 폐쇄 기간을 변화시킴으로써 부상의 정도를 제어 할 수 있습니다. 신호 전달 경로와 부상 코어와 주변부에서와 손상되지 않은 동측 및 반대측 조직의 조직 학적 변화의 시험은 더 미성숙 뇌의 손상 및 수리의 메커니즘을 규명 할 수 있습니다. 이 연구는 뇌 발달이 중요한 손상 모델을 시연 할 예정이다.
프로토콜 내에서 중요한 단계
모두 미성숙과 성숙 동물의 뇌 손상의 진행에 모두 저체온증 (17)과 고열 (18)의 효과가 알려진대로 첫째는, 전체 복구까지 마취의 개시로부터 정상 체온을 유지하는 것이 중요하다. 동물을 고정하고 호흡을 모니터링하고 기관이 압축이 없도록 절개 최적의 위치를 권취하면서 둘째, 필수적이다. 이 미주 신경 자극과 심박수의 변화를 초래할 수 셋째, 압착 또는 미주 신경 연신 피한다. ICA에의 철회는 arteriotomy 동안 출혈을 제어 할 필요가 있기 때문에 넷째, 관심이 동맥 손상을 방지하기 위해 수축하는 동안 긴장의 정도에 지불해야합니다. 동맥이 수축에서 눈물 않으면 가난한 arteriotomy 절개가있는 경우, 또는 동물 인해 위험 분석에서 제외되어야한다출혈 가난한 재관류.
수정 및 문제 해결
참조 MRI를 사용하여 봉합 길이 실리콘 팁이 제대로 국소 허혈을 만들기 위해 MCA를 폐색하도록 최적화 될 수있다. MRI를 사용할 수없는 경우 절개가 봉합의 위치를 시각화하기, 새끼는 재관류 전에 안락사 할 수있다. 필요에 따라 봉합 길이를 조정합니다. 강아지의 무게는 매우 교합 봉합 길이 요구와 상관 관계. 교합 시간은 부상의 심각성의 정도를 조정하기 위해 수정 될 수 있습니다.
또한, 봉합의 모양과 길이가 중요합니다. 19-21 g의 무게 P10의 Sprague-Dawley 계 롱 에반스 쥐들 10 mm의 경험에 삽입 최적의 길이이다. 교합 봉합사의 추가의 삽입은 MCA 천공 될 수있다. 또한, 각각의 수술에 흡장 필라멘트 형상의 일관성 부상 P 농도의 증가가 발생할 것attern 19, 20. 이러한 이유로, 우리는이 특정 목적을 위해 전문적으로 제조 봉합사를 사용하는 것이 좋습니다. 부상 패턴으로 인해 기술에서 보이는 분 차이로 실무자 사이에 다를 수 있습니다하는 것이 중요하다.
기술의 한계
작은에서이 기술을 수행, 설치류를 개발하는 것은 상당한 경험이 필요합니다. 제대로 수행 한 경우, 의사는 다른 크기의 동물에서 매우 일관된 부상 패턴의 원인이 95 % 이상의 생존율을 달성 할 수 있습니다. 또한, 적절한 수술 도구가 필수적입니다. 수술 도구가 아니라 모든 악기 팁이 제대로에 근접하도록 유지해야합니다.
기존 또는 대체 방법에 대한이 기술의 중요성
저산소증 – 허혈, 또는 쌀-Vannucci 모델이 동안 </SUP>, 가장 일반적으로 개발 뇌의 저산소증 – 허혈 손상을 연구하는 데 사용됩니다, 재관류 단계 다음 글로벌 저산소증없이 일시적 국소 허혈이,이 결과 tMCAO의이 모델이 점에서 HI에서 구별되는 것이 중요합니다 때 장애물을 제거하고 혈액의 흐름이 복원됩니다. 이보다 일관되고 재현 부상을 야기보다 임상 적으로 번역 만삭 신생아 뇌졸중에서 본 것과 유사한 부상 패턴을 일으키는 것입니다. 이것은 초점 부상 패턴과 손상되지 않은 조직의 보상 반응의 연구를 할 수 있습니다.
이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용
이 모델은 인간의 신생아 뇌졸중의 가장 흔한 원인은 주 산기 (11), (21) 중에 발생하는 일시적인 폐색 성 혈전과 비슷합니다. 병인은 완전히 명확하지 않다 가장 가능성이 다원적이지만, 대부분의 경우 t으로 추정된다O 태반 (11)로부터 전달 색전 기인한다. 또한, 이후의 발작이나 미세한 국소 신경 학적 시험 종종 본 추정 획 산기 많은 신생아 22 나 비정상. 이 부상을 진행하고 중요한 가능한 치료 전략의 메커니즘을 식별 할 수있는 일관된 번역 손상 모델의 사용을합니다.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |