Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Slag i nyfødtperioden er en vesentlig årsak til død og uførhet, som forekommer i så mange som 1 av 2300 levende fødte 1. Dette fører til endrede sentralnervesystemet utvikling og økt langtids sykelighet, inkludert økt forekomst av epilepsi, cerebral parese, mental retardasjon, og andre typer av motor eller kognitiv dysfunksjon. Livslang effekt av tidlig hjerneslag gjør translasjonsforskning dyremodeller avgjørende for å undersøke mekanismene for skade og reparasjon i denne populasjonen, inkludert strategier for å beskytte den skadde hjernen eller for å forbedre reparasjon.
Forskjellige ischemi modeller er blitt brukt til å studere hjerneskade hos voksne dyr, og mens den Rice-Vannucci (modifisert Levine) 2 Prosedyren er vanligvis brukt for å studere hypoksisk-iskemisk skade i den utviklende hjerne, er fokal ischemi-reperfusjon en distinkt skademekanisme forårsaker fokus skade, med en skadet kjerne og penumbra og uskadd fjerntliggende vev. De Koizumi 3 og 4 Longa modeller ble utviklet hos voksne rotter for å oppnå forbigående tilstopping av midtre cerebralarterie via den felles karotidarterie (CCA) og ytre halsarterie (ECA), henholdsvis. I begge modeller, permanent ligering og etsing av arterien grener er viktig for å minimalisere blødning og for å effektivisere den kirurgiske prosedyren, noe som også fører til uheldige virkninger på dyrets evne til å mate og for å få vekt etter skade. Videre er det forskjellige skademekanismer i den umodne hjernen og spesifikke mønstre av skade sett på som et resultat.
Flere nylig, photothrombotic hjerneslag (Rose-Bengal metoden) 5 og permanent MCA ligation 6 har blitt brukt til å studere neonatal og voksen hjerneslag. Både photothrombotic slag og MCA ligering skape permanente endringer i cerebral blodstrøm som resulterer i en mangel på reperfusion. Reperfusjon er en kritisk komponent for utvikling og progresjon av fokal skade, med økt eksitotoksisitet, dannelse av frie radikaler, og nitrogenoksidproduksjon fører til forsinket celledød som innebærer signale kaskader som er forskjellig fra den ischemiske fase 7. Hypoksi-ischemi involverer permanent ensidig carotis ligering etterfulgt av global hypoksi, som også skiller seg fra årsaken til hypoksisk-iskemisk skade på mennesker og forårsaker ikke en konsistent fokal skade mønster, slik at undersøkelse av den skadede kjerne og penumbra mer utfordrende.
Vi har tidligere beskrevet et ikke-blødende iskemi-reperfusjon slagmodell i den umodne rotter ved hjelp av transient middels cerebral arterieokklusjon (MCAO) 8, 9, 10. Dette er en mindre invasiv metode som har tilgang og tilstopper MCA via arteria carotis interna uten permanent ligatipå eller cauterization. Dette tilveiebringer en modell for skade lik den vanligste årsaken for slag i perinatalperioden 11, 12. Denne iskemi-reperfusjon modell av skaden fører til skade på den ipsilaterale striatum og parieto-temporale cortex. Denne modellen av tMCAO tillater også kontroll over graden av skade ved å variere varigheten av okklusjon. Undersøkelse av signalveier og histologiske forandringer i den skadede kjerne og penumbra og i den uskadde ipsilaterale og kontralaterale vev kan ytterligere belyse skademekanismer og reparasjon i den umodne hjernen. Denne studien vil demonstrere denne viktige skademodell for utviklingen av hjernen.
Kritiske trinnene i protokollen
For det første er det viktig å opprettholde normothermia fra start av anestesi helt full gjenoppretting, som det er kjente effekter av både hypotermi 17 og hypertermi 18 på progresjon av hjerneskade i både umodne og modne dyr. For det andre, mens sikring dyret og tilbaketrekking av innsnitt, optimal plassering for å overvåke puste og for å sikre at luftrøret er fri for komprimering er nødvendig. For det tredje unngår å klemme eller strekking av nervus vagus, da dette kan føre til endringer i hjertehastighet med vagus-stimulering. Fjerde, fordi tilbaketrekking av ICA er nødvendig for å kontrollere blødning under arteriotomien, oppmerksomhet må betales til graden av spenning under tilbaketrekking for å unngå å skade arterien. Dersom arterien ikke rive fra retraksjon, eller om det er en dårlig arteriotomi innsnitt, dyret bør utelukkes fra analysen på grunn av risikoenfor blødning og reperfusjon dårlig.
Modifikasjoner og feilsøking
Ved hjelp av MRI som en guide, kan sutur-lengde optimaliseres for å sikre at silikonstykke ordentlig tilstopper MCA for å skape den fokal ischemi. Dersom MR ikke er tilgjengelig, kan valpene avlives før reperfusjon for disseksjon å visualisere plassering av sutur. Juster sutur lengde etter behov. Pup vekt høyt korrelerer med de krav til lengde okkluderende sutur. Okklusjonen tid kan endres for å justere graden av skadegrads.
I tillegg sutur form og lengde er kritisk. For P10 Sprague-Dawley og Long Evans hannrotter som veide 19-21 g, hvilket er 10 mm den optimale lengden av innsetting i vår erfaring. Ytterligere innføring av den okkluderende suturen kan resultere i perforering av MCA. Videre vil konsistensen i form av at lukkingen av filamentet i hvert kirurgi resulterer i en øket konsistens for skade pattern 19, 20. Av denne grunn anbefaler vi å bruke profesjonelt produsert sting for dette formålet. Det er også viktig å merke seg at skademønsteret kan variere mellom utøvere på grunn av tilsynelatende små forskjeller i teknikk.
Begrensninger av teknikken
Utfører denne teknikken i en liten, utvikle gnager krever betydelig erfaring. Hvis det utføres riktig, er kirurgen i stand til å forårsake en svært konsekvent skademønster på tvers av dyr av forskjellige størrelser og oppnå en overlevelse på mer enn 95%. Videre riktige kirurgiske verktøy er avgjørende. Kirurgiske instrumenter må være godt vedlikeholdt for å sikre at alle instrument tips tilnærmet riktig.
Betydningen av denne teknikken i forhold til eksisterende eller alternative fremgangsmåter
Mens hypoksi-ischemi, eller ris-Vannucci modell 2 </sup>, er mest vanlig brukt for å studere hypoksisk-iskemisk skade i den utviklende hjerne, er det viktig å merke seg at denne modellen av tMCAO er forskjellig fra HI ved at det er transient fokal ischemi uten global hypoksi, etterfulgt av en reperfusjonsfasen når hindringen er fjernet, og blodstrømmen er gjenopprettet. Dette fører til en mer konsekvent og reproduserbar skade og er mer klinisk translasjonsforskning ved å forårsake en skade mønster som ligner den som ble sett i full sikt neonatal slag. Dette gjør studiet av fokale skademønster og kompenserende tiltak i uskadd vev.
Fremtidige søknader etter å mestre denne teknikken
Denne modellen er lik den vanligste årsaken for slag hos mennesker nyfødte, en forbigående okklusiv trombe som oppstår under perinatalperioden 11, 21. Årsaken er ikke helt klart, og er mest sannsynlig multifaktoriell, men det forutsettes i de fleste tilfeller to resultere fra emboli som passerer fra placenta 11. I tillegg har mange nyfødte med antatt perinatal slag ofte til stede med senere anfallsaktivitet eller subtil fokale neurologisk undersøkelse feil 22. Dette gjør bruken av en konsistent, translatorisk skade-modell for å identifisere skademekanismer progresjon og mulige terapeutiske strategier avgjørende.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |