Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Инсульт в неонатальный период является одной из основных причин смерти и инвалидности, происходящий в целых 1 в 2300 живорожденных 1. Это приводит к развитию измененном центральной нервной системы и увеличение долгосрочной заболеваемости, в том числе рост заболеваемости эпилепсией, церебральным параличом, умственной отсталости и других типов двигателя или когнитивной дисфункции. На протяжении всей жизни последствия раннего инсульта делает поступательные модели животных необходимы для изучения механизмов повреждения и восстановления в этой группе населения, включая стратегии защиты травмированного мозга или для улучшения ремонта.
Различные модели ишемии были использованы для изучения повреждения головного мозга у взрослых животных, и в то время как Райс-Vannucci (Modified Levine) 2 процедуры обычно используется для изучения гипоксический-ишемического повреждения в развивающемся мозге, очаговая ишемия-реперфузия является отчетливым механизмом повреждения в результате чего фокусных травм, с травмированным сердечником и Penumbra и неповрежденная удаленная ткань. Модели Коидзуми 3 и 4 Лонга были развиты у взрослых крыс , чтобы достичь переходных окклюзия средней мозговой артерии с помощью общей сонной артерии (ССА) и наружную сонную артерию (ECA), соответственно. В обеих моделях, постоянная перевязка и прижигание ветвей артерии важны свести к минимуму кровотечения и оптимизировать хирургическую процедуру, которая также вызывает неблагоприятное воздействие на способности животной кормить и набрать вес после повреждения. Кроме того, существуют различные механизмы травмы в незрелом мозге и специфические модели травмы видели в результате.
Совсем недавно, Фототромботический инсульт (метод Rose-Bengal) 5 и постоянный MCA перевязка 6 были использованы для изучения новорожденного и взрослого инсульта. Оба Фототромботические инсульт и MCA перевязки создают постоянные изменения в мозговом кровотоке, которые приводят к отсутствию reperfusион. Реперфузия является важным компонентом развития и прогрессирования очагового повреждения, с повышенной эксайтотоксичностью, образованием свободных радикалов, а также продукциями оксида азота , ведущих к замедленной гибели клеток , что включает в себя каскады, которые отличаются от ишемической фазы 7 сигнализации. Гипоксия-ишемия предполагает постоянную перевязку односторонний сонной следует глобальной гипоксия, которая также отличается от причины гипоксический-ишемического повреждения в организме человека и не вызывает последовательную фокусную картину травмы, что делает изучение травмированного ядра и полутени более сложной.
Ранее мы описали не-геморрагическую инсульт модель ишемии-реперфузия в незрелых крысах с использованием переходной окклюзии средней мозговой артерии (МСАО) 8, 9, 10. Это менее инвазивный метод, который получает доступ и закупоривает MCA через внутреннюю сонную артерию без постоянного ligatiили прижигание. Это обеспечивает модель травмы , аналогичную наиболее распространенной причиной инсульта в перинатальном периоде 11, 12. Это ишемия реперфузии модель результатов травмы в ущерб ипсилатеральной стриатуме и теменно-височной коры. Эта модель tMCAO также позволяет контролировать тяжести травмы путем изменения длительности окклюзии. Исследование сигнальных путей и гистологических изменений в травмированном ядре и полутени и в неповрежденной ипсилатеральной и контралатеральной ткани может дополнительно пролить свет на механизмах повреждения и восстановления в незрелом мозге. Это исследование продемонстрирует эту важную модель повреждения для развивающегося мозга.
Критические шаги в рамках протокола
Во- первых, это очень важно для поддержания нормотермию от начала анестезии до полного выздоровления, поскольку существуют известные эффекты как гипотермии 17 и гипертермии 18 на прогрессирование повреждения мозга в обоих незрелых и зрелых животных. Во-вторых, при обеспечении животных и втягивания надрез, оптимальное положение для контроля дыхания и гарантировать, что трахея свободен от сжатия имеет важное значение. В-третьих, во избежание сдавливания или растяжения блуждающего нерва, так как это может привести к изменению частоты сердечных сокращений с стимуляции блуждающего нерва. В-четвертых, потому что втягивание МКА необходимо контролировать кровотечение во время артериотомии, внимание должно быть уделено степени натяжения при отводе, чтобы избежать повреждения артерии. Если артерия действительно оторвать от втягивания, или если есть плохая артериотомия надрез, животное должно быть исключено из анализа из-за рисккровотечения и плохой реперфузии.
Модификации и устранение неисправностей
Использование МРТ в качестве руководства, длина шва может быть оптимизирована для обеспечения того, чтобы кончик силикона правильно закупоривает MCA для создания фокусной ишемии. Если МРТ не доступна, щенки могут быть умерщвлены перед тем реперфузии для рассечения визуализировать размещение шовного материала. Отрегулируйте длину шва по мере необходимости. Вес щенка высоко коррелирует с требованиями длинами поглощающего шовных. Время закупорки может быть изменено, чтобы регулировать степень тяжести травмы.
Кроме того, форма и длина шва имеют решающее значение. Для P10 Sprague-Dawley и Long Evans крыс весом 19-21 г, 10 мм оптимальная длина вставки в нашем опыте. Дальнейшее введение окклюзионного шва может привести к перфорации MCA. Кроме того, последовательность в форме окклюзионного нити в каждой операции приведет к повышенной консистенции травмы рattern 19, 20. По этой причине мы рекомендуем использовать профессионально изготовленные швами для этой конкретной цели. Важно также отметить, что модель травмы могут отличаться между специалистами-практиками из-за, казалось бы малейшие различия в технике.
Ограничения техники
Выполнение этой техники в небольшом, развитии грызуна требует значительного опыта. Если выполнено правильно, хирург может вызвать очень систематический травматизм в животных разных размеров и достичь коэффициента выживаемости более чем на 95%. Кроме того, соответствующие хирургические инструменты имеют важное значение. Хирургические инструменты должны быть в хорошем состоянии, чтобы гарантировать, что все советы инструмента аппроксимировать правильно.
Значение этого метода в отношении существующих или альтернативных методов
В то время как гипоксия-ишемия, или рисовый Vannucci модель 2 </SUP>, наиболее часто используется для изучения гипоксически-ишемическое повреждение в развивающемся мозге, важно отметить, что эта модель tMCAO отличается от HI в том, что преходяще фокальной ишемией без глобальной гипоксии, с последующей фазой реперфузии, когда обструкция удаляется и кровоток восстанавливается. Это приводит к более последовательным и воспроизводимым травмам и более клинический поступательным, вызывая картину травмы, сходную с наблюдаемым в доношенном новорожденном инсульте. Это позволяет изучать фокусные модели травматизма и компенсаторные реакции в неповрежденной ткани.
Будущие приложения после освоения этой техники
Эта модель аналогична наиболее распространенная причина инсульта у человека, новорожденных переходный окклюзионный тромб , которое происходит в перинатальный период 11, 21. Этиология не совсем понятно, и, скорее всего, многофакторный, но предполагается, в большинстве случаев то результате эмболии , проходящей из плаценты 11. Кроме того, многие новорожденные с предполагаемым перинатальным инсультом часто присутствуют с более поздней эпилептической активностью или тонким фокальным неврологическим экзаменом аномалия 22. Это делает использование последовательной, поступательной модели повреждения для выявления механизмов прогрессирования повреждения и возможных терапевтических стратегий имеет решающее значение.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |