Neonatal stroke is a significant cause of early brain injury requiring a translational model with consistent focal injury patterns and high reproducibility in order to enable study. This study describes the detailed surgical procedure for creating a non-hemorrhagic, unilateral focal ischemia-reperfusion injury in full-term-equivalent rodents.
A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature and mature brain. Stroke occurs commonly in the perinatal period in humans, and transient ischemia-reperfusion is the most common form of stroke in neonates. The reperfusion phase is a critical component of injury progression, which occurs over a period of days to weeks, and of the endogenous response to injury. This postnatal day 10 (p10) rat model of transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) creates a unilateral, non-hemorrhagic focal ischemia-reperfusion injury that can be utilized to study the mechanisms of focal injury and repair in the full-term-equivalent brain. The injury pattern that is produced by tMCAO is consistent and highly reproducible and can be confirmed with MRI or histological analyses. The severity of injury can be manipulated through changes in occlusion time and other methods that will be discussed.
Stroke under nyföddhetsperioden är en betydande orsak till död och handikapp, förekommer i så många som en av 2300 levande födda 1. Detta leder till förändrad centrala systemutveckling nervös och ökad långsiktig sjuklighet, inklusive ökad förekomst av epilepsi, cerebral pares, mental retardation, och andra typer av motor eller kognitiv dysfunktion. De livslånga effekterna av tidig stroke gör translationdjurmodeller avgörande för att undersöka mekanismerna för skada och reparation i denna population, inklusive strategier för att skydda den skadade hjärnan eller för att förbättra reparation.
Olika ischemi modeller har använts för att studera hjärnskada hos vuxna djur, och medan Rice-Vannucci (Ändrad Levine) 2 förfarande används ofta för att studera hypoxisk-ischemisk skada i den växande hjärnan, är fokal ischemi-reperfusion en tydlig mekanism för skador orsaka brännskador, med en skadad kärna och Penumbra och oskadad fjärr vävnad. De Koizumi 3 och Longa 4 modeller utvecklades i vuxna råttor för att uppnå övergående mellersta hjärnartären ocklusion via den gemensamma halsartären (CCA) och yttre halsartären (ECA), respektive. I båda modellerna, permanent ligering och kauterisation av artär grenar är viktigt att minimera blödning och för att effektivisera den kirurgiska proceduren, vilket också orsakar skadliga effekter på djurets förmåga att mata och gå upp i vikt efter skada. Vidare finns det distinkta mekanismer skade i omogen hjärna och specifika mönster av skada som ses som ett resultat.
På senare tid har photothrombotic stroke (Rose-Bengal-metoden) 5 och permanent MCA ligation 6 använts för att studera neonatal och vuxen stroke. Både photothrombotic stroke och MCA ligation skapa permanenta förändringar i cerebralt blodflöde som resulterar i en brist på reperfusJon. Reperfusion är en kritisk komponent i utvecklingen och progressionen av fokal skada, med ökad excitotoxicitet, bildning av fria radikaler, och kväveoxidproduktion som leder till fördröjd celldöd som innebär signaleringskaskader som skiljer sig från den ischemiska fasen 7. Hypoxi-ischemi innebär permanent unilateral karotidligering följt av global hypoxi, som också skiljer sig från orsaken till hypoxisk-ischemisk skada hos människor och inte orsakar en konsekvent fokal skada mönster, vilket gör undersökning av den skadade kärnan och Penumbra mer utmanande.
Vi har tidigare beskrivit en icke-hemorragisk ischemi-reperfusion stroke modell i omogen råtta med användning av övergående mellersta hjärnartären ocklusion (MCAO) 8, 9, 10. Detta är en mindre invasiv metod som har åtkomst och ockluderar MCA genom den inre halsartären utan permanent ligatipå eller kauterisation. Detta ger en modell av skada liknar den vanligaste orsaken till stroke under den perinatala perioden 11, 12. Denna ischemi-reperfusion modell skaderesulterar i skador på ipsilaterala striatum och parieto-temporal cortex. Denna modell av tMCAO tillåter också kontroll över hur allvarlig skada genom att variera längden på ocklusion. Undersökning av signalvägar och histologiska förändringar i den skadade kärnan och halvskuggan och i den oskadade ipsilateral och kontralateral vävnad kan ytterligare belysa mekanismerna för skada och reparation i den omogna hjärnan. Denna studie kommer att visa denna viktiga modell skada för den växande hjärnan.
Kritiska steg inom det protokoll
För det första är det viktigt att upprätthålla normotermi från initieringen av anestesi tills fullständig återhämtning, eftersom det är kända effekterna av både hypotermi 17 och hypertermi 18 på utvecklingen av hjärnskada i både omogna och mogna djur. Sekund, medan säkring av djuret och tillbakadragning av snittet, optimal placering för att övervaka andning och för att säkerställa att luftstrupen är fritt från kompressions är viktigt. För det tredje, undviker att klämma eller sträcka vagusnerven, eftersom det kan orsaka förändringar i hjärtfrekvens med vagal stimulering. För det fjärde, eftersom indragning av ICA är nödvändigt för att kontrollera blödning under arteriotomy, uppmärksamhet måste ägnas till graden av spänning under indragning att undvika skador på artären. Om artären går sönder från indragning, eller om det är en dålig arteriotomy snitt, djuret bör uteslutas från analys på grund av riskenav blödning och dålig reperfusion.
Ändringar och felsökning
Med hjälp av MRI som en guide kan suturen längd optimeras för att säkerställa att silikonspetsen sluter ordentligt MCA för att skapa fokus ischemi. Om MRI inte är tillgängligt får valpar avlivas före reperfusion för dissekering att visualisera placeringen av suturen. Justera suturen längd som behövs. Valpen vikt korrelerar starkt med krav den ockluderande suturen längd. Ocklusion tid kan modifieras för att justera graden av skadornas svårighetsgrad.
Dessutom sutur form och längd är kritiska. För P10 Sprague-Dawley och Long Evans-råttor av hankön vägande 19-21 g, den 10 mm den optimala längden av insättning i vår erfarenhet. Ytterligare införing av ockluderande suturen kan resultera i perforering av MCA. Vidare kommer konsistensen i form av den ockluderande filamentet i varje operation resultera i en ökad konsistens av skada pattern 19, 20. Av denna anledning rekommenderar vi att du använder professionellt tillverkade suturer för detta specifika ändamål. Det är också viktigt att notera att skadan mönstret kan variera mellan utövare på grund av till synes små skillnader i teknik.
Begränsningar av tekniken
Utföra denna teknik i en liten, utveckla gnagare kräver betydande erfarenhet. Om det utförs på rätt sätt, är kirurgen kan orsaka en mycket konsekvent skada mönster över djur av olika storlekar och uppnå en överlevnadsgrad högre än 95%. Dessutom ordentliga kirurgiska verktyg är viktigt. Kirurgiska instrument måste vara väl underhållas för att säkerställa att alla instrument tips approximerar ordentligt.
Betydelsen av denna teknik med avseende på befintliga eller alternativa metoder
Medan hypoxi-ischemi eller Rice-Vannucci modell 2 </sup>, används oftast för att studera hypoxisk-ischemisk skada i den växande hjärnan, är det viktigt att notera att denna modell av tMCAO skiljer sig från HI i att det är övergående fokal ischemi utan global hypoxi, följt av en reperfusion fas när obstruktion avlägsnas och blodflödet återställs. Detta orsakar en mer konsekvent och reproducerbar skada och är mer kliniskt translationell genom att orsaka en skada mönster liknande det som ses i fullgångna neonatal stroke. Detta gör det möjligt att studera brännskador mönster och kompensatoriska svar i oskadad vävnad.
Framtida tillämpningar efter att behärska denna teknik
Denna modell liknar den vanligaste orsaken till stroke i humana nyfödda, ett transient ocklusiv tromb som sker under den perinatala perioden 11, 21. Etiologin är inte helt klar och är troligen multifaktoriell, men det förutsätts i de flesta fall to resultera från emboli som passerar från moderkakan 11. Dessutom har många nyfödda med förmodade perinatal stroke ofta närvarande med senare anfallsaktivitet eller subtil fokal neurologisk undersökning Avvikelser 22. Detta gör användningen av en konsekvent, translationell skada modell för att identifiera mekanismer för skador progression och möjliga terapeutiska strategier avgörande.
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by the NIH K08 NS064094 and UCSF REAC grants. The authors would like to acknowledge Nikita Derguin, Zinalda Vexler, and Joel Faustino for their assistance in the development of this technique.
Isoflourane | Henry Schein | 50033 | anesthetic, at 3% |
Trinocular Surgioscope | World Precision Instruments | PSMT5N | |
Heating pad | Sunbeam | 000731-500-000 | low to medium setting |
IR Thermometer | Extech Instruments | 72-5270 | |
Retraction kit for small animals | Fine Science Tools | 18200-20 | |
CermaCut Scissors | Fine Science Tools | 14958-09 | |
Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 112522-00 | 2x |
Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | 2x |
B-2 Micro Clamp | Fine Science Tools | 00398-02 | |
Forcepts for Clamp Application | Fine Science Tools | 00072-14 | |
Micro Vannas Scissors | Fine Science Tools | 15000-03 | 2mm cutting edge |
Occlusion Sutures | Doccol | 602123PK10 | 701712PK5Re |
Ruler | Fine Science Tools | ||
Hemostatic Agent | Avitene | DVL1010590 | |
6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture | Ethicon | 769G | |
Euthasol | Virbac | 710101 | 0.22 ml/kg |
Cotton Tipped Applicators | Henry Schein | 100-9249 | |
Laboratory Tape | VWR | 89097-990 |