Temperature-sensitive (ts) lethal mutants are valuable tools to identify and analyze essential functions. Here we describe methods to generate and classify ts lethal mutants in high throughput.
Systematic identification and characterization of genetic perturbations have proven useful to decipher gene function and cellular pathways. However, the conventional approaches of permanent gene deletion cannot be applied to essential genes. We have pioneered a unique collection of ~70 temperature-sensitive (ts) lethal mutants for studying cell cycle regulation in the unicellular green algae Chlamydomonas reinhardtii1. These mutations identify essential genes, and the ts alleles can be conditionally inactivated by temperature shift, providing valuable tools to identify and analyze essential functions. Mutant collections are much more valuable if they are close to comprehensive, since scattershot collections can miss important components. However, this requires the efficient collection of a large number of mutants, especially in a wide-target screen. Here, we describe a robotics-based pipeline for generating ts lethal mutants and analyzing their phenotype in Chlamydomonas. This technique can be applied to any microorganism that grows on agar. We have collected over 3000 ts mutants, probably including mutations in most or all cell-essential pathways, including about 200 new candidate cell cycle mutations. Subsequent molecular and cellular characterization of these mutants should provide new insights in plant cell biology; a comprehensive mutant collection is an essential prerequisite to ensure coverage of a broad range of biological pathways. These methods are integrated with downstream genetics and bioinformatics procedures for efficient mapping and identification of the causative mutations that are beyond the scope of this manuscript.
Fenotypisk karakterisering av systematiske muterte samlinger av modellorganismer er en anerkjent metode for å dissekere celle kompleksitet. Den haploid encellede grønnalger Chlamydomonas reinhardtii har en plante-lignende gen set, men det splittet fra landplanter før flere genom duplikasjoner i landanlegget avstamning 2. I prinsippet, mangel på genduplikasjon og et hovedsakelig haploid livssyklus i stor grad forenkler tap-av-funksjon genetiske tilnærminger. Imidlertid er målrettet avbrytelse av gener som er av interesse nesten umulig på grunn av mangel på effektive homologe genomiske integrasjons. En tilfeldig insertional avbrudd biblioteket er under bygging, kombinert med identifikasjon av forstyrret området, så langt som gir en Arrayed sett av 1,935 kartlagt forstyrrelser som representerer 1.562 gener 3. Imidlertid er denne tilnærmingen (forventet generelt å produsere null mutasjoner) gjelder ikke for viktige gener. Temperaturfølsom (TS) mutasjoner kan recovered på essensielle gener, og nyere metoder tillater effektiv identifikasjon av det muterte genet og utløsende lesjon. Fenotypisk analyse ved høy temperatur gir deretter øyeblikkelig informasjon om funksjonen av det muterte genet. Vi rapporterte på isolering og karakterisering av ts dødelige mutasjoner i ~ 70 essensielle gener i Chlamydomonas, med fokus spesielt på gener som er involvert i cellesyklusprogresjon og kontrollere 1,4.
Ts dødelige skjermer har vært en bærebjelke i genetisk analyse i mikroorganismer i flere tiår 5,6. I prinsippet er en ønskelig egenskap for å nærme seg "metning", som betyr at alle gener i stand til å mutere til ts dødelighet er identifisert ved hjelp av minst en mutant, slik at en fullstendig analyse. Men i praksis, flere faktorer begrenser tilnærming til metning. Først, mens nesten alle genene kan bli mutert til tap av aktivitet ved høy temperatur, effektiviteten av utvinningen av slike mutanter, varierer over i det minsteen størrelsesorden 7,8. Derfor begynner en tilfeldig skjermen for å plukke opp gjentatte treff i "hyppige flyers" lenge før metning er kontaktet. For det andre, mens ts mutasjoner som oftest resultere i reduksjon av funksjon, de kan ikke være sanne nullverdier ved en restriktiv temperatur (og omvendt, er ofte ikke fullt ut funksjonell på en ettergivende temperatur). Dette problemet kan bli behandlet til en viss grad ved å sammenligne flere alleler; hvis de alle deler en felles fenotype, er det større sannsynlighet for å reflektere et resultat av enkle inaktivering av genet. Flere lene er også svært nyttig for definitive molekylær identifisering av utløsende lesjon en. Men den "frequent flyer" problemet betyr at flere alleler i sjelden treffer gener kan være vanskelig å gjenopprette.
Av disse grunner, har vi utviklet en forbedret rørledning for å isolere og fenotypisk karakter ts mutanter. Vi har samlet over 3000 ts mutanter så langt, jegncluding ca 200 nye kandidat cellesyklus mutasjoner. Molekylær og fenotypisk analyse av denne samlingen, som allerede sannsynlig inneholder mutasjoner i de fleste eller alle celle-essensielle trasé, bør gi ny innsikt og hypoteser i plantecellebiologi. Viktigere, kan denne rørledningen brukes på alle mikroorganismer som vokser på agar for å effektivt bygge ts mutant samlinger.
En kommentar om utstyr: to roboter er svært viktig for effektiviteten i denne prosedyren (en koloni velgeren og en kombinasjon kopi plater / cherry picker). Pickers vanligvis har metall pinner. Plukket kolonier holdes i luften på disse pinnene for en viss periode (sekunder til minutter, avhengig av modell). Chlamydomonas dør i ca 20 sek på en metallpinne i luften. Dette begrenser valget modell for organismen. Nøyaktighet saker. Vår koloni picker er rimelig nøyaktig; men det er noe voldelig i sin handling, og har noen mulighet for spray-baserte krysskontaminering. Det er ikke brukt ved høyEr enn 384 tetthet (4,5 mm senter-senteravstand); ved denne tetthet, er fullstendig akseptabel nøyaktighet. Den kopiplate / kirsebær plukke robot (ulike vedlegg som brukes for disse programmene) er mye tregere ved plukking, men er nøyaktig nok for 1536 tetthet (6144 er en utfordring, selv for denne svært nøyaktig robot, vi har vurdert dette tetthet men valgt ikke å bruke det på grunn av sine ulike problemer). Roboten vil ikke fungere bra hvis platene er lastet ujevnt, osv. Det er viktig å få øye-sjekk for å være sikker på at de riktige tingene skjer; selvfølgelig, vil roboten kjøre uten tilsyn og generelt alt vil gå bra hvis de første platene var riktige.
Rørledningen er beskrevet her for high yield isolering av ts dødelige mutanter sikrer at formodentlig alle mobiltelefon-essensielle pathways av Chlamydomonas genomet er representert. De to mest kritiske trinn for effektiv innsamling av potensielle cellesyklus gener og for eliminering av repeterende "frequent flyer" alleler er: 1) sammenhengende definisjon av arrest fenotype karakteristika for ufullstendige cellesykluser og 2) parallellkomplemente analysen mot allerede identifisert spørring gener for å forstørre samlingen med nylig isolerte seg.
Når synkronisert med lys-mørk sykluser, vokser Chlamydomonas photosynthetically dagtid og økning i cellestørrelse> 10x uten DNA replikasjon eller celledeling 13. Omtrent samtidig med utbruddet av natten, ble celler deretter gjennomgår gjentatte behandlinger med vekslende DNA-replikasjon, mitose, og celledeling (figur 8). Dette forskrifts scheme gir en naturlig skille mellom gener som primært er nødvendig for cellevekst og integritet og gener som kreves spesielt for celledeling syklus. Vi fant at 10-timers og 20-timers tidspunkter er veldig informative for en innledende grov fenotypiske kuttet en. Den brede klasser av ts dødelige mutanter som vi kjenner i dag, basert på disse bildene (se SI i Tulin og Cross, 2014) 1, er: Notch, Popcorn, Round, Small, Medium, tidlig lyse, og flere syklus (Figur 8 ).
De tre mest relevante kategoriene vi fokuserer på er Notch, Popcorn, og Round. De "hakk" og "Popcorn" fenotyper ble vist tidligere å være karakteristisk for de fleste cellesyklus-spesifikke lesjoner (f.eks mitotisk cyklin-avhengig kinase, DNA-replikasjon maskineri, og topoisomerase II) 1. Utseendet til en (Notch) eller flere (Popcorn) tilsynelatende flyene av begynnende men mislykket celledeling er en praktisk morphological indikator på cellesyklus innvielse. Disse mutantene generelt utviser liten eller ingen vekst defekter, med økninger i celle volum lik WT på 10-timers mark. Hakket og popcorn fenotyper er tydelig på 10 timer og er fullt utviklet (ofte assosiert med cellelyse) med 20 hr. "Round" celler vokse på samme måte som WT, men med mye redusert produksjon av tilsynelatende begynnende deleflatene, noe som gir store, runde arrestert celler. Tidligere mutanter i denne kategorien har falt i komponenter i anaphase fremmende komplekse 14 eller i gener som kreves for microtubule funksjon (tubulin-folding kofaktorer, gamma-tubulin ring kompleks) 1. På senere tidspunkt, disse cellene ofte oppviser utpreget cellelyse.
"Small" og "Medium" celler vokse enten ubetydelig (Small) eller betydelig mindre enn WT (Medium). Mange av disse mutantene er identifisert til å ha skader i genene hvis merknader foreslår roller i grunnleggende Cellular vekstprosesser (oversettelse eller membran BIOGENESIS). Hoved mikroskopiske diskriminering mellom Medium og Round hviler på mengden av veksten på 10 timer (Round: som WT, Medium: redusert). Fordi de små og mellom kategoriene er ganske stor og trolig gjenspeile lesjoner i et stort utvalg av mobilnettet veier, er vi ikke forsøker å mette disse kategoriene; Men vi ønsker å molekylært identifisere representanter for klassen å forstå fenotyper av tap i ulike veier. To unstudied kategoriene er: 1) den tidlige-lysering av mutanter som taper integritet (tap av grønn farge, tap av refractility) ved 10-timers mark, med lite bevis for forhåndscellevekst og 2) flere sykluser. Celler proliferere på samme måte som WT ved 10 og 20 timer, selv om de utviser en fullstendig manglende evne til å utføre mer langsiktig proliferasjon.
Vi har for det meste karakteriserer "hakk", "popcorn" og "rund" og inkluderer små og mellomstore runde celler, så velsom lekk mutanter at fullstendig noen celledelinger. Dette er først og fremst å sikre at grunnleggende cellulære funksjoner, for eksempel vekst og membran integritet, er funksjonelle og berike sannsynligheten for divisjonens relaterte gener. Denne fremgangsmåten er funnet å være empirisk effektiv; Det kan imidlertid være at en cellesyklus gen er pleiotropisk og har flere roller tidligere i G1, før selve delingen. Slike saker, som vi forventer å være sjelden, er savnet. Mer generelt har vi som mål for homogen arrest, som i stor sannsynlighet skyldes en utløsende mutasjon som er en helt dysfunksjonell protein. Imidlertid, av samme grunn som nettopp beskrevet, kan det være flere arrest punkter, og derfor er tilrådelig å velge kandidater viss fleksibilitet.
For å berike samlingen med nylig identifiserte gener, blir de valgte kandidatene analysert for komplemente. Vi krever TS- i den positive kontroll (spørring mot spørring mutasjon) og ts + i den negative kontroll (query mot WT). Nye mutanter i samme complementation gruppe som spørringen er TS-. Medlemskap i samme komplemente konsernet reflekterer nesten alltid en molekylær lesjon i det samme genet (dette har vært tilfelle for hvert slikt gen vi har testet). Derfor, for "hyppige flyers," dette kriteriet er ekskluderende for videre karakterisering. Mutanter som ikke var på samme komplemente grupper som de testede søk er kandidater til nye gener og er videre preget av bioinformatikk og eksperimentelle verktøy. Sterkt variable utvinning av TS- alleler i ulike komplemente grupper er et velkjent fenomen, det vil si, er variabiliteten markert større enn Poisson støy, på grunn av den store iboende variabilitet mutability til TS- mellom forskjellige gener. Årsaker kan inkludere iboende thermolability forskjeller; ulike protein størrelser; tilstedeværelsen av et protein som en monomer versus som en stor, stabilisert kompleks; og mutagene hot spots. Dette er nesten en ren nuisaNCE. Men en resulterende gunstig utfall at "frequent flyer" listen er ikke lang (med bare noen få mål som opptar mesteparten av listen), så arbeidskrevende komplemente testing er ikke en massiv oppgave før de senere stadier av prosjektet.
Som en komplementær måte, utførte vi en binding assay. I denne analysen blir dobbelt-resistente progenies valgt ut og testet for en TS- fenotype. En TS- fenotype er ventet (og observert) for mutanter i samme komplemente gruppe som spørringen eller for tett knyttet mutasjoner. For hver av de testede gener, er et WT avkom forventes å dukke (ts + fenotype) i en viss sannsynlighet, avhengig av den genetiske avstand. Vi anslår at det er rundt 100 zygosporer for hver parring i disse plassene. Forutsatt 100% meiotisk effektivitet, vil dette resultere i rundt 100 dobbel resistent avkom fra den frakoblede narkotika motstand kassetter (25% av meiotisk avkom, fire per meiose, på grunn av Mendelian arv). Dette vil også være tilfelle for TS- mutasjoner, hvor 25% av progenies vil være dobbelt-mutant, og 25% vil være WT om søket og test mutasjoner er opphevet. Derfor ut av dobbel resistent avkom, vil 25% være WT (rundt 25 celler). Dette er tilfellet for helt ukoblet mutasjoner; imidlertid, moderat binding (i ~ 20 cm, omtrent 2 Mb, eller 2% av genomet 115) vil sterkt redusere eller eliminere ts + signalet. I tilfellet med binding av de testede mutasjonen overfor antibiotika kassetten, ts + haploids som er dobbelt resistent er til stede i svært små mengder. Dette manifesterer seg som tilsynelatende manglende rekombinerer med alle mutanter testet, til tross utfyller alle mutanter testet, et avvikende resultat som er lett bemerket; I slike tilfeller vil tilbakekryssing løse problemet.
Både fra forkunnskaper og fra sekvensanalyse, forventer vi cellesykluskinaser gener i Chlamydomonas å være rundt 500 gener 2, selv om most, men sannsynligvis ikke alle, er avgjørende. Vi vil vurdere behovet for ytterligere runder mutagenese som flere mutanter blir samlet og metningsnivået stiger.
Denne prosedyren er unikt utformet for å studere viktige biologiske prosesser og gener og proteiner som bærer dem ut. Andre metoder for å generere forstyrrelser i viktige gener eksisterer (for eksempel transformasjon av tilfeldig mutageniserte alleler 16, betinget transkribert alleler 17 eller hypomorphic alleler 18). Men de alle krever homolog rekombinasjon, som er sterkt undertrykket i vegetative Chlamydomonas. Den gruppert regelmessig interspaced kort palindromisk repeat (CRISPR) / Cas9 system er etablert som et kraftig verktøy for genmodifisering 19; imidlertid, er det likevel å arbeide effektivt i Chlamydomonas 20. Kritisk, alle disse metodene krever forkunnskaper i målet. Dette er en alvorlig begrensningdersom man ønsker å ha muligheten til å lære noe nytt! Vår tilnærming vil gi mutasjoner identifisere viktige gener, uavhengig av noen forkunnskaper. Derfor på det nåværende nivå av teknologi, isolering av tilfeldige ts mutasjoner fulgt av genet identifikasjon av dyp sekvensering kan være den mest effektive metoden for å få rask inntreden i mikrobiell cellebiologi i anlegget superkingdom.
Identifisering av årsaks mutasjoner (blant ~ 100 kodesekvens skiftende mutasjoner i hver klone) er utenfor omfanget av denne artikkelen. Deep sekvensering av bulked segregant bassenger 1 er effektiv, men arbeidskrevende. Et kombinatorisk basseng strategi for bestemmelse av alle mutasjoner i et stort antall stammer, etter sekvensering av et lite antall av bassenger, er meget kostnads- og arbeidsbesparende. En ny strategi for kombinatorisk bulked segregant sekvensering er under utvikling som vil tillate identifisering av årsaks mutasjoner i dusinvis av mutanter simultaneously i et enkelt sekvense kjøre (under forberedelse). Disse effektivitet er svært viktig for å tillate den kritiske genet identifikasjonstrinn for å holde tritt med den meget hurtige akkumulering av mutanter som er gjort mulig ved fremgangsmåtene beskrevet her.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Cross lab medlemmer for råd og nyttig diskusjon. Dette arbeidet ble støttet av PHS 5RO1-GM078153 og etter en Junior Fellow pris fra Simons Foundation til Michal Breker.
Equipment: | |||
Hudson RapidPick colony picker | Hudson Robotics | ||
MultiDrop Combi Reagent Dispenser | Thermo Scientific | 5840300 | |
Small tube metal tip cassette | Thermo Scientific | 24073295 | |
Singer RotoR replica-plating robot | Singer Instruments | Very essential for the process. For lower scale screenings you can use an in-house manual tool | |
Singer single-colony picking attachment (‘Stinger’) | Singer Instruments | Can be picked manually, however for large scales it is nearly impossible | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
SYTOX Green Nucleic Acid Stain | ThermoFisher Scientific | S7020 |