قياس النتريت والنترات، الأيضية في اكسيد النيتريك المسار، في المواد البيولوجية باستخدام أسلوب التوهج
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
أكسيد النيتريك (NO) هي واحدة من الجزيئات منظم الرئيسية في التوازن الأوعية الدموية وكذلك الناقلات العصبية. يتأكسد أنتجت إنزيمي NO إلى النتريت والنترات من التفاعل مع مختلف البروتينات أوكسي الهيم وغيرها من مسارات تزال غير معروفة. عملية عكسية، انه تم اكتشاف الحد من النتريت والنترات إلى NO في الثدييات في العقد الماضي، وتحظى باهتمام واحدة من المسارات الممكنة إما منع أو تخفيف مجموعة كاملة من القلب والأوعية الدموية، التمثيل الغذائي واضطرابات العضلات التي يعتقد أن تترافق مع انخفاض مستويات NO. ولذلك فمن المهم لتقدير كمية NO وعناصره في أماكن الجسم المختلفة – الدم وسوائل الجسم والأنسجة المختلفة. الدم، نظرا لسهولة الوصول إليها سهلا، غير مقصورة يفضل استخدامها لتقدير NO الأيض. نظرا لعمر البطارية القصير (أجزاء قليلة من الثانية)، وانخفاض تركيز الفرعية nanomolar، قياسات مباشرة وموثوقة من الدم NO <em> في الجسم الحي الحالية صعوبات تقنية كبيرة. ومن ثم، يقدر لا توفر عادة على أساس كمية من منتجاتها الأكسدة، والنتريت والنترات. دائما قياس هذه الأيض بشكل منفصل. هناك عدة طرق راسخة لتحديد تركيزها في السوائل والأنسجة البيولوجية. هنا نقدم بروتوكول لطريقة التوهج (CL)، استنادا إلى الكشف spectrophotometrical من NO بعد نتريت أو نترات الحد من ثلاثي يوديد أو الفاناديوم (III) حلول كلوريد، على التوالي. حساسية لالنتريت والنترات الكشف هو في نطاق منخفض nanomolar، الذي يحدد CL كأسلوب الأكثر حساسية المتاحة حاليا لتحديد التغيرات في NO المسارات الأيضية. نحن يشرح بالتفصيل كيفية تحضير عينات من السوائل والأنسجة البيولوجية من أجل الحفاظ على كميات الأصلية من النتريت والنترات موجودة في ذلك الوقت من جمع وكيفية تحديد كميات كل منها في العينات. القيود المفروضة على تقنية CL هي أيضا إكسبlained.
Introduction
النتريت، وإلى أقل تمديد نترات، ومستويات في الدم تعكس الحالة العامة للجسم NO الأيض. تركيزات النيتريت في الدم ومعظم الأعضاء والأنسجة ليست سوى في nanomolar ارتفاع أو انخفاض مجموعة مكرومولي، نترات موجودا عادة بكميات أعلى من ذلك بكثير – في نطاق مكرومولي. التغيرات في مستويات نتريت نتيجة لتطور المرض أو التغيرات في العادات الغذائية هي صغيرة جدا، ويمكن قياسها فقط باستخدام طريقة حساسة جدا. بسبب مختلف جدا مستوياتهم وعمليات الأيض المختلفة، تقرير منفصل من مستويات النتريت والنترات أمر ضروري. ما يسمى ب "أكاسيد النيتروجين تقرير" حيث يتم قياس النتريت والنترات معا له قيمة ضئيلة جدا.
وقد وضعت عدة طرق لقياس النتريت في مختلف العينات البيولوجية – الأكثر شيوعا هي أقدم واحد، استنادا إلى رد فعل Griess التي تم وصفها في الأصل في عام 1879. وحتى مع modificatio الحديثم، والحد حساسية لالنتريت يمكن بلوغه من خلال طريقة Griess "في مجموعة مكرومولي منخفضة. التوهج (CL)، جنبا إلى جنب مع ثلاثي يوديد الحد من الحل، ويعتبر في الوقت الراهن الأسلوب الأكثر حساسية، مما يسمح الكمي في نطاق nanomolar انخفاض تركيزات النتريت 1-8،10،11. نفس الأسلوب CL، جنبا إلى جنب مع الفاناديوم (الثالث) كلوريد الحد من الحل، ويمكن استخدامها لقياس حساسة من النترات، مع الدقة في نطاق nanomolar 9.
CL يكشف NO الغاز الحر. لذلك، والنتريت والنترات وR-nitrosothiols (R-SNO)، R-nitrosoamines (R-NNO)، أو مركبات معدنية-NO (في وقت لاحق في مخطوطة النحو المشار إليه "R- (X) الذي تكن له")، لا بد من تحويلها إلى تحرير NO الغاز من أجل تحديد قيمها الأصلية عن طريق CL. وحققت التحويل إلى NO تستخدم عدة حلول الحد مختلفة، اعتمادا على طبيعة NO الأيض. بعد التحويل، يتم إزالة الحرة NO الغاز من وعاء التفاعل من قبل الناقل للغاز (و، N2 أو هارون) في دائرة رد الفعل من CL محلل حيث يتم الجمع بين الأوزون (O 3) مع NO لتشكيل ثاني أكسيد النيتروجين (NO 2) في حالته تفعيلها. مع العودة الى ارض الدولة، NO 2 * تنبعث في منطقة الأشعة تحت الحمراء، والكشف عن الفوتون المنبعث من مضخم (PMT) صك CL. شدة الضوء المنبعث يتناسب طرديا مع تركيز NO في دائرة رد الفعل، والذي يسمح حساب تركيز الأنواع الأصلية باستخدام منحنيات المعايرة المناسبة.
في بروتوكول لدينا، ونحن الحالي أول تقرير يستند CL من النتريت والنترات في إعدادات السريرية الأكثر استخداما – في الدم والبلازما، وبعد ذلك نناقش كيفية تحديد هذه الأيونات في عينات الأنسجة. نفسر أيضا بالتفصيل كيفية الحفاظ على تركيز النتريت الفسيولوجية الأصلي في بيئات النتريت رد الفعل، مثل الدم والمقصورات لها والبلازما وخلايا الدم الحمراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
خطوات حاسمة في إطار بروتوكول
aliquots من كل الحلول (بما في ذلك الماء) المستخدمة في إعداد، وتمييع أو علاج عينات الأصلي يجب أن تحفظ ودققت لاحتمال النتريت أو (في كثير من الأحيان) تلوث نترات. وجدنا أن معظم التلوث يأتي من الماء والكثير من الم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب يريدون الاعتراف إسهامات حاسمة من الدكتور عبد Dejam وMM بلاتير في تطوير استخدام النتريت الحفاظ حل للقياسات النتريت في الدم.
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
- Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E., Hancock, J. T. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. 476, 11-28 (2008).
- Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
- Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
- Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
- Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
- Smárason, A. K. 1., Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).
- Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
- Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
