Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Måling nitrit og nitrat, metabolitter i Nitrogenoxid Pathway, i biologisk materiale ved hjælp af Chemiluminescence Method

doi: 10.3791/54879 Published: December 25, 2016

Abstract

Nitrogenoxid (NO) er en af ​​de vigtigste regulator molekyler i vaskulær homeostase og også en neurotransmitter. Enzymatisk produceret NO oxideres til nitrit og nitrat ved interaktion med forskellige oxy-hæm proteiner og andre stadig ikke kendte veje. Den omvendte proces, reduktion af nitrit og nitrat til NO var blevet opdaget i pattedyr i det sidste årti, og det er ved at vinde opmærksomhed som en af ​​de mulige veje til enten at forebygge eller lindre en lang række kardiovaskulære, metaboliske og muskelsygdomme, der menes at være forbundet med reducerede niveauer af NO. Det er derfor vigtigt at vurdere mængden af ​​NO og dets metabolitter i forskellige organ rum - blod, kropsvæsker og de forskellige væv. Blod, på grund af sin let tilgængelighed, er det foretrukne rum, der anvendes til estimering af NO metabolitter. På grund af sin korte levetid (få millisekunder) og lav koncentration sub-nanomolær, direkte pålidelige målinger af blod NO <em> in vivo nuværende store tekniske vanskeligheder. INGEN tilgængelighed er således normalt estimeret baseret på mængden af ​​dets oxidationsprodukter, nitrit og nitrat. Disse to metabolitter altid måles separat. Der er flere veletablerede metoder til at bestemme deres koncentrationer i biologiske væsker og væv. Her præsenterer vi en protokol for kemiluminescensmetode (CL), baseret på spektrofotometriske påvisning af NO efter nitrit eller nitrat reduktion af tri-iodid eller vanadium (III) chlorid løsninger, hhv. Følsomheden for nitrit og nitrat opdagelse er i lav nanomolær rækkevidde, der sætter CL som den mest følsomme metode øjeblikket er til rådighed til at bestemme ændringer i NO metaboliske veje. Vi forklarer i detaljer, hvordan at forberede prøver fra biologiske væsker og væv med henblik på at bevare de originale mængder af nitrit og nitrat til stede på tidspunktet for indsamlingen, og hvordan at bestemme deres respektive mængder i prøver. Begrænsninger af CL-teknik er også explained.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nitrit, og til en mindre udvide nitrat, niveauer i blodet afspejler overordnede tilstand af kroppens NO stofskifte. Nitrit-koncentrationer i blod og de fleste organer og væv er kun i høje nanomolære eller lav mikromolære område, nitrat er sædvanligvis til stede i meget højere mængder - i mikromolære område. Ændringer i nitrit niveauer på grund af sygdomsprogression eller ændrede kostvaner er helt små og kan kun måles ved hjælp af en meget følsom metode. På grund af deres meget forskellige niveauer og forskellige metaboliske processer, separat bestemmelse af nitrit og nitrat niveauer er afgørende. Såkaldte "NOx beslutsomhed", hvor nitrit og nitrat måles sammen har meget lidt værdi.

Der er udviklet adskillige fremgangsmåder til kvantificering nitrit i forskellige biologiske prøver - de mest almindelige er den ældste, baseret på Griess reaktion, som oprindeligt var blevet beskrevet i 1879. Selv med moderne modifications, følsomheden grænse for nitrit opnåelige ved Griess-metoden er i lav mikromolære område. Kemiluminescens (CL), kombineret med tri-iodid reducerende opløsning, betragtes i øjeblikket som den mest følsomme metode, tillader kvantificering i det lave nanomolære område af nitrit-koncentrationer 1-8,10,11. Den samme CL metode, kombineret med vanadium (III) chlorid reducerende opløsning, kan anvendes til følsomme målinger af nitrat, med præcision i det nanomolære område 9.

CL registrerer fri gas NO. Derfor nitrit, nitrat, R-nitrosothioler (R-SNO), R-nitrosoaminer (R-NNO), eller metal-NO-forbindelser (senere i manuskript benævnt "R- (X) -NO"), skal omregnes til gratis ingen gas for at kvantificere deres oprindelige beløb via CL. Omdannelse til NO opnås ved anvendelse af flere forskellige reducerende løsninger, afhængigt af arten af ​​NO metabolit. Efter konvertering, er gratis NO gas udrenset fra reaktionsbeholderen ved en bæregas (Han, N2 eller Ar) i reaktionen kammer CL analysator hvor ozon (O 3) er kombineret med NO danner nitrogendioxid (NO 2) i aktiveret tilstand. Med tilbagevenden til grundtilstanden, NO 2 * udsender i infrarøde område og udsendt foton detekteres ved fotomultiplikator (PMT) i CL instrument. Intensiteten af ​​emitteret lys er direkte proportional med NO-koncentration i reaktionskammeret, hvilket muliggør beregning af koncentrationen af ​​de oprindelige arter anvender de rette kalibreringskurver.

I vores protokol, vi først til stede CL-baserede bestemmelse af nitrit og nitrat i de mest brugte kliniske - i blod og plasma, og så må vi drøfte, hvordan man bestemme disse ioner i vævsprøver. Vi forklarer også i detaljer, hvordan at bevare den oprindelige koncentration fysiologiske nitrit i nitrit-reaktive miljøer, såsom blod og rum, plasma og røde blodlegemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle protokoller, herunder brug af dyr blev godkendt til brug af NIDDK Animal Care og brug Udvalg og humant blod blev opnået fra NIH Blood bank fra raske donorer.

1. Prøvefremstilling

  1. Fremstilling af nitrit bevare opløsning
    1. Der fremstilles en opløsning indeholdende 890 mM kaliumferricyanid (K3Fe (CN) 6) og 118 mM NEM (N-ethylmaleimid) i destilleret vand. Opløs godt, indtil det er klart gul uden tilstedeværende krystaller. Tilføj NP-40 (octyl phenoxylpolyethoxylethanol) i en 1: 9-forhold (volumen / volumen, NP-40 / opløsning). Bland forsigtigt for at undgå skumning og opbevares ved 4 ° C i ca. en uge).
  2. Indsamling og udarbejdelse af blodprøver
    1. Indsamle blod under anvendelse af mindst en 20 G nål for at undgå hæmolyse med heparin for at forhindre koagulation (5 U / ml). For hele blodprøven, bland blod med nitrit bevare opløsning umiddelbart i et 1: 4 ratio (v/ V opløsning / blod).
    2. For plasma og røde blodlegemer prøver, centrifuge det opsamlede blod i 5 minutter ved 4.000 xg ved 4 ° C for at adskille røde blodlegemer (RBC) og plasma. Tag supernatanten (plasma) og bland det med nitrit bevare opløsning som beskrevet ovenfor til bestemmelse af nitrit niveauer i plasma.
    3. Fjern forsigtigt resterende plasma og buffy coat fra prøven og pipette RBC prøve fra bunden af ​​røret for at undgå kontaminering med andre typer blodceller under anvendelse af en cut-off pipettespids, og anbringes i et rør indeholdende nitrit bevare opløsning i den samme forhold som ovenfor.
    4. Hver prøve blandes (plasma og RBC) med kold methanol i et forhold 1: 1 eller 1: 2 (v / v prøve / methanol) og centrifugere dem ved 13.000 xg ved 4 ° C i 15 minutter for at udfælde proteiner. Tag supernatanten og bruge det til nitrit måling eller nedfryses fremstillede prøver, hvis det er nødvendigt, på tøris og opbevares ved -80 ° C.
      Bemærk: Nitrit rea hurtigtcts med oxyhæmoglobin (oxyHb) i bloddannende nitrat. Da oxyHb er altid til stede i stort overskud i forhold nitrit, denne reaktion fører til næsten fuldstændig udslettelse af nativt blod nitrit med en tidsramme på ~ 10 min. For at bevare de fleste af endogent blod nitrit, er nitrit-bevarelse opløsning tilsat til fuldblodsprøver umiddelbart efter blodudtagningen. Løsningen vil hurtigt lyserer røde blodlegemer og oxidere oxyHb til methæmoglobin (MetHb), en inaktiv form af hæmoglobin, som ikke reagerer kemisk med nitrit.
  3. Forberedelse af prøver fra andre typer af kropsvæske
    1. Efter prøvetagning i passende beholder, bland godt med nitrit bevare løsning, deproteinate og måle straks eller fryses og opbevares ved -80 ° C.
  4. Indsamling og udarbejdelse af vævsprøver
    1. Indsamle væv fra dyr perfunderet med hepariniseret saltopløsning (10 U HEPArin / ml). Excise ca. 1 g ønsket væv og homogeniseres enten under anvendelse af en manuel homogenisator eller en automatiseret homogenisator.
    2. Tilføj kendt mængde nitrit bevare opløsning efter behov for at opnå glat homogenat.
    3. Når væv homogeniseres, udfælde proteiner med kold methanol (1: 1 eller 1: 2-forhold v / v prøve / methanol) som beskrevet ovenfor, hvorefter den centrifugeres prøver ved 13.000 xg ved 4 ° C i 15 min.
    4. Samle bundfald og måle nitrit niveauer. Hvis det er nødvendigt, fryse prøver på alle stadier af forberedelse på tøris og opbevares ved -80 ° C.

2. Udarbejdelse af Reduktion Solutions

  1. Tri-iodid (I 3) reduktion opløsning til nitrit og R- (X) -NO artsbestemmelse 1,3,4
    1. Forbered en opløsning af 301 mM KI sammen med 138 mM I 2 opløsning i vand. Bland med iseddikesyre i 2: 7-forhold (volumen / volumen opløsning / syre) på en magnetisk omrører i ~ 30 min, indtil alleKrystallerne opløses. Fortrinsvis holde i mørk flaske, da iodid er lysfølsomt, og brug inden for en uge fra forberedelse.
      Bemærk: Denne løsning vil reducere nitrit til NO, og det vil også frigive NO fra R-SNO, R-NNO og Fe-NO funktionelle grupper (R- (X) -NO), men nitrat vil ikke blive berørt. Signalet fra de ovennævnte NO-baserede funktionelle grupper kan adskilles fra sand nitrit signal ved behandling af halvdelen af ​​prøven med sur sulfanilamid (AS) og sammenligne AS-behandlede og ubehandlede signal. AS irreversibelt danner diazonium kation med nitrit og dette kompleks kan ikke reduceres ved jeg 3 løsning. For AS behandling, forberede 290 mM opløsning af sulfanilamid i 1 M HCl og føje den til en portion af prøven i forholdet 1: 9 (v / v AS / prøve). Mål CL signal i AS-behandlede og ubehandlede dele af prøven. Beregn den sande nitrit signal som en forskel på AS-behandlet og ubehandlet del af prøven. Nitrit kan også måles ved anvendelse af en selektiv nitrite-reducerende opløsning af ascorbinsyre / eddikesyre-blanding som beskrevet i del 2.2. Men på grund af den normalt lille mængde R- (X) -NO arter til stede, målinger ved hjælp AS-ubehandlede prøver er i de fleste tilfælde en meget god tilnærmelse af den samlede nitrit indhold.
  2. Ascorbinsyre / eddikesyre (4A) opløsning til selektiv bestemmelse af nitrit 2
    1. Forbered 500 mM ascorbinsyre i vand. Bland denne opløsning med iseddikesyre i et forhold 1: 7 (v / v, ascorbinsyre / eddikesyre) til fremstilling af reaktionsblandingen.
      Bemærk: Denne løsning er specifik for nitrit, vil ikke frigive NO fra enhver R- (X) -NO art eller nitrat. Imidlertid må opløsning af ascorbinsyre og eddikesyre fremstilles frisk hver dag, før målingerne, ascorbinsyre let oxiderer i opløsning.
      Afslutning af nitrit reduktion afhænger af ascorbinsyre koncentration; og mindst 50 mM ascorbinsyre anbefales til fuldstændig reduction af plasma nitrit. Det anbefales dog, at udføre et par pilotforsøg med forskellige koncentrationer af ascorbinsyre og nitrit standarder i det forventede nitrit koncentrationsinterval før endelige prøve målinger. Husk, at ascorbinsyre lidt opbruger under målingerne, er så hyppige ændringer af reaktionsblandingen i glasset reaktionskammeret anbefales.
  3. Vanadium (III) chlorid reducerende opløsning til nitrat bestemmelse 9
    1. Forbered 51 mM opløsning af VCL 3 i 1 M HCI. Filter løsning gennem 200 um filter og opbevares i en mørk flaske, bruge inden for to uger.
      Bemærk: Denne løsning vil reducere nitrat, nitrit og alle R- (X) -NO arter, så hvis sammenlignelige mængder af nitrit eller andre R- (X) -NO arter er til stede sammen med nitrat, den endelige nitratindholdet skal beregnes som forskellen mellem CL signaler opnået med VCL 3 og jeg3 reducerende løsninger.

3. Kemiluminiscens (CL) Analyzer Opsætning og Målinger

  1. Standardopløsning
    1. Forberede 1 uM opløsning af natriumnitrit (NaNO2). Den samme løsning kan anvendes til nitrit og nitrat bestemmelser.
  2. Brug NO-analysatoren
    Bemærk: I øjeblikket er der to kommercielt tilgængelige INGEN analysatorer, der er følsomme nok til biologiske forskningsformål - Sievers NOA og Ecophysics CLD 88Y. De er begge opererer på det samme princip; den vigtigste forskel er, at CLD 88Y bruger ilt fra luften i rummet for at gøre ozon (O 3), mens NOA kræver en ekstern ilt tank til dette formål. Proceduren nedenfor beskriver opsætningen for Sievers NOA.
    1. instrument setup
      1. Udfør indledende opsætning af den NO-analysatoren ifølge producentens anbefalingersom set på figur 1.
      2. Åbent O 2 tank tilsluttet instrumentet. Vælg "analyse" og "enter" fra hovedmenuen på frontpanelet. På næste skærmbillede vælger "start" og tryk "Enter". Tilslut syren fælde (indeholdende 1 M NaOH) til instrumentet, som det ses i figur 1.
      3. Vent indtil fotomultiplikator køler til temperatur under -12 ° C, og reaktionskammeret evakueres til 6 torr. Det tager omkring 30 minutter at nå en stabil flad basislinie. Den baseline skal stabilisere inden for 1 - 2 mV, den nominelle værdi er mindre vigtig end dens stabilitet.
        Bemærk: Hvis nitrat måles, tænde for køling vandbad (indstillet ved 4 ° C, der tjener som kold fælde for syre og vanddampe) og opvarmning vandbad (den vigtigste reaktionskammer, 95 ° C). Hastigheden for reduktionen af nitrat til NO i VCL 3 løsning er temperaturafhængige, og det er meget langsom ved stue temperatur, er nødvendig, således væsentlig forøgelse af temperaturen for at observere reaktionen.
      4. Åbn Han tank og tilslut glasset reaktionskammeret til syre fælde som ses på figur 1. Fyld reaktionskammeret med passende reducerende opløsning, reducere boblende til minimum og forbinde reaktionskammer til syren fælde. Brug trial and error, justere han boblende sats at matche instrumentets suge sats (oftest ~ 200 ml / min for Siever s NOA).
      5. Tænd computeren styrer instrumentet og starte Labview-baserede Liquid software. Sådan aktiverer du kommunikationen mellem instrumentet og købet software, tryk på "enter" når i "data menuen" indtil skærmen læser "output aktiveret", og tryk derefter på "klar" at vende tilbage til skærmen data.
      6. Vent et stabilt baseline spor på skærmen og begynde at injicere prøver og nitrit standarder i reduktion løsning gennem skillevæggen. Altid vente med at nå frem til en stabil basislinje agterudis de højdepunkt. Dette kan tage op til 2 min. Liquid software har en mulighed for at "mærke" tider af injektion og anmærke injektionen, og det vil eksportere disse kommentarer i en separat fil (filename.info) som et nyttigt supplement til den datafil (filename.data).
      7. Når prøver og standarder måles, skal du vælge "stop" i Liquid software menu - dette vil skrive data fra en midlertidig fil i en permanent fil kaldet "filename.data". Ved at trykke "abort" valgmulighed ophører måling uden at skrive indsamlede data til en permanent fil.
      8. For at afslutte eksperimentet, afbryde maskinen fra reaktionsbeholderen ved at slukke for stophane på toppen af reaktionsbeholderen og afbryd slangen mellem syre fælde og reaktionsbeholderen (se figur 1). Nu stopper NOA analysator - tryk på "klar", gå til "analyse", sætte maskinen på "standby" og "bekræft" standby. Hvis anvendes regelmæssigt, deninstrument kan efterlades i standby i flere uger. Slå tilførsel af ilt. Skyl derefter den reducerende opløsning fra reaktionskammeret, afbryde og lukke Han brændstoftanken fra glasreaktionsbeholder og Afslut rengøringen reaktionsbeholder.
    2. Standarder og prøve injektioner
      1. Injicer 50 pi 1 pM nitrit opløsning ind reaktionsblandingen ved anvendelse af en grundigt vasket Hamilton-sprøjte. Vent i mindst 1 - 2 ud min mellem injektionerne for at opnå god separation af toppe. Gentag injektion af 50 pi at få dubletter til hvert datapunkt. Vask sprøjten med deioniseret vand efter hver injektion.
      2. At erhverve komplet sæt af data for standardkurve, fortsætte med duplikerede injektioner af 100, 150 pi (yderligere 200 pi kan være nødvendig, hvis der forventes høje koncentrationer af nitrit eller nitrat) på 1 uM nitrit løsning. I hvert tilfælde, sørge for at vente, indtil signalet falder tilbage til baseline og derefter erhverve 1 - 2 min af baseline for at opnå god separation af toppe.
        Bemærk: Nitrit standarder kan måles på ethvert tidspunkt under eksperimenter. Det er imidlertid foretrukket at erhverve standardkurven før måledata, da den også tjener som en uafhængig kontrol af instrumentets funktionalitet.
        Når data indsamles, prøvemængde injicerede bør føre til godt markante toppe. Det bør dog holdes for øje, at fotomultiplikator er lineær kun op til ~ 800 mV, så ingen af ​​toppen bør være højere end ~ 700 mV. Dette kan opnås enten ved at reducere af beløb indsprøjtet prøve eller fortynde prøven med demineraliseret vand. Hvert punkt bør måles i hvert fald i to eksemplarer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 2 viser repræsentative resultater indsamlet fra standarder og fem forskellige prøver. Som vist i denne figur, fotomultiplikator spændingen stiger umiddelbart efter nitrit-holdige opløsning (standarder eller prøver) injiceres i reducerende opløsning (injektioner gange er angivet med røde pile under kurven) og vender tilbage til basislinieværdien når alle nitrit til stede i det injicerede opløsning blev reduceret. Det er også klart af denne figur, at målingerne nøjagtige volumen er nødvendige for at opnå meget reproducerbare data. Vi anbefaler at bruge præcision Hamilton sprøjter til at måle injektionsvoluminer. Tabet af den reducerede kapacitet af I 3 (eller ascorbinsyre eller VCL 3) opløsning er en anden almindelig kilde til fejl. Som en generel regel, når baseline bredde toppe begynder at vokse betydeligt, reducere opløsning i reaktionskammeret skal ændres. Bredden af ​​top afhænger af gasstrømmen ind i NOEt reaktionskammer (markeret som RC på figur 1), og det lidt varierer fra eksperimentelt sat op til en anden. Vi anser den normale bredde til at være omkring 1 min for nitrit målinger og op til 2 min for nitrat målinger.

For at relatere signalet fra fotomultiplikator med mængden af NO påvist, er en standardkurve konstrueret som en afbildning af arealet af den top, og mængden af nitrit (i pmol) injiceret som set på figur 3A. For at måle arealet af den top enhver egnet software kan bruges, såsom oprindelse, Excel eller lide. Hældningen af denne kurve, K (markeret med rødt i figur 3B), giver mængden af pmol af NO forårsager stigning på 1 mV af fotomultiplikator (PM) signal. Fordelen ved at anvende hældningen af ​​kurven, snarere end arealet under toppe, der er relateret til fast mængde af NO, er forøget præcision. Standardkurven er konstrueret af mindst 3 forskelligepoint, hver af dem, der måles in duplo, og hvis der er nogen resterende nitrit eller nitrat i vandet anvendt til fremstilling af standardopløsning ved anvendelse K eliminerer nødvendigheden af ​​korrektioner til denne restmængder. Efter vores indledende tests af NOA instrument for sin PM linearitet, vi bestemt også, at lineær respons sker op til 700-800 mV. Derfor er vores standardkurve gælder for alle signaler fra prøver op til denne PM interval. Lineariteten afhænger af PM og kan ændre sig med tiden. Det skal afgøres, før instrumentet først brugt og testet som PM aldre hvert par år.

Data indsamlet fra prøver behandles på samme måde som data indsamlet for standardkurve: Først arealet af den top, bestemmes. Så dette er delt af hældningen K fra standardkurven, hvilket angiver antallet af pmol NO stammede fra den indsprøjtede prøve.

figur 3B. Data afbildes derefter på lignende måde som eksempel i figur 3B. I eksemplet i figur 3B afbildet vi resultater fra 5 individuelle prøver vist i panel A. Her vi plotter middelværdier fra 2 injektioner og give SD at vise reproducerbarheden af de individuelle punktmålinger.

For prøverne i figur 3, S1, S2 og S4 er rotteblod og S3 og S5 rottelever. Figur 3C viser de endelige resultater plot sammen med SD og udtrykt i nM (for blod, n = 3) eller pmol / mg væv (lever, n = 2).

figur 1
Figur 1: Opsætning af Sievers NOA Kemiluminescens Instrument. Reaktionsbeholderen fyldes med I 3 (ascorbinsyre / eddikesyre eller VCL 3) opløsning med He bæregas blidt gennembobling. Prøve injiceres ved brug af Hamilton sprøjte gennem skillevæggen ind I 3 løsning, hvor NO-relaterede komponenter er reduceret til NO gas og transporteres ind NO-analysatoren. Kolde fælde, NaOH-fyldte fælde, og filter beskytter analysator mod fugtighed og syredampe. I reaktion kammer (RC) NO gas kombineres med O 3 (genereres i O 3 generator) fra ilt fra O 2 tank. Kemiluminescens signal fra NO 2 * detekteres af fotomultiplikatorrøret (PMT) og yderligere forstærkes og bearbejdes. Dataindsamling og -analyse udføres på PC. vakuumpumpeskabt undertryk i reaktionskammeret (RC) og evakuerer giftig NO 2 gas efter kemiluminescens måling gennem kulfilter (CF). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Repræsentant Grund af NO toppe Dannet af CL. Denne graf viser fotomultiplikator (PMT) signal som funktion af tiden. Peaks skyldes injektioner af forskellige mængder af 1 pM nitrit opløsning (standarder) og 100 pi prøver (S1 - S5) injiceret i dubletter og tre eksemplarer (50 pi af nitrit standardopløsning). Røde pile under kurven angiver tider med injektioner. Klik her for at se a larger version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Standard Curve (A) og Repræsentative resultater fra Rat Blood and Liver (B), Final Results Plot (C). Standardkurve (panel A) blev opnået ved at injicere 50, 100 og 150 pi 1 pM nitrit opløsning i vand, måle arealet under toppene. Hældningen, K (red nummer) giver nmol NO kræves for en 1 mV stigning i fotomultiplikator spænding. Original toppe anvendes til standardkurve er i figur 2 og er mærket som 50, 100 og 150 pi. Figur 2 viser også de oprindelige injektioner til vores prøver - S1, S2 og S4 (mørkegrå) fra rotte blod, S3 og S5 fra rotte levervæv, alle injiceret i to eksemplarer. Arealet under disse toppe blev målt, og efter alle korrektioner for fortyndinger blev fremstillet som beskrevet i del 3.2.1., ResÜLTS vist i panel B for individuelle prøver blev beregnet som mængden af nitrit i pmol / g lever eller i nM for blod. For at forstå reproducerbarhed kemiluminescensmetoden, vi plottede gennemsnittene og standardafvigelser for hver enkelt prøve. Panel C viser den endelige produkter nitrit og nitrat i rotte blodet og leveren afbildet som gennemsnittet af tre individuelle prøver til blod og to for leveren sammen med standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritiske trin i protokollen

Prøver af alle løsninger (herunder vand), der bruges til at forberede, fortynde eller på anden måde behandle oprindelige prøver skal gemmes og kontrolleres for mulig nitrit eller (oftere) nitrat forurening. Vi fandt, at de fleste forurening kommer fra vand og mange kemikalier anvendes til behandling af prøven (ferricyanid navnlig) også indeholde signifikant mængde nitrat forurening i nogle partier, der forstyrrer den endogene nitrat bestemmelse. Vi kontrollerer derfor alle vores kemikalier til nitrit og nitrat forureninger før vi bruger dem i regelmæssig eksperiment.

Da prøverne kan blive udsat for betydelige fortyndinger flere gange under behandlinger, der skal dokumenteres for endelige koncentration beregninger alle prøve manipulationer. De fleste fejl er lavet i denne del af protokollen.

Ved håndtering prøver til nitrit målinger, hurtig overførsel tilnitrit bevare opløsning er afgørende, især når hæm-holdige proteiner, såsom hæmoglobin, som reagerer med nitrit og oxiderer det til nitrat, er til stede. Når stabiliseret, kan prøverne fryses til langvarig opbevaring før analyser.

Mængder af adskillige NO metabolitter i biologiske prøver (især RX-NO) er meget lave, undertiden niveauerne af dannet NO er ​​i baggrundsstøjniveauet af NOA analysatoren. Det er altid at foretrække at fremstille prøver med så lidt fortynding som muligt, hvis sådanne forbindelser skal måles.

Begrænsninger af teknikken

Med omhyggelig prøveforberedelse og injektioner, den lave grænse for følsomhed er tæt på 20 nM af NO addukt stede i fuldt forberedt prøve. De sædvanlige biologiske koncentrationer af nitrit og nitrat gøre overskride disse koncentrationer imidlertid R- (X) -NO beløb kan falde tæt på dette område.

CL høje sensomhed kræver omhyggelig prøveforberedelse og målinger præcise volumen.

Betydningen af ​​CL med Respekt til alternative NO Metabolit Målinger

Kemiluminescens (CL) er en meget følsom metode til påvisning af NO, nitrit, nitrat og RX-NO. I øjeblikket er CL betragtes guldstandarden inden for bestemmelse af NO og dets metabolitter.

Andre almindelige alternativ til bestemmelse nitrit er Griess reaktion (GR). GR er en praktisk og billig kolorimetrisk metode baseret på diazotering reaktion beskrevet af Peter Griess i 1879. Analyse af nitrat kræver forudgående kemisk eller enzymatisk reduktion af nitrat til nitrit. Bedste nuværende kommercielt tilgængelige kits har følsomhed omkring 100 nM for nitrit, følsomhed fleste kits tillader at bestemme nitrat og nitrat er i lav um. Når du bruger GR at bestemme nitrit og nitrat i prøven, der kræves to trin; Først bestemmes nitrit amount i første portion af prøven, derefter bruge anden portion til at reducere nitrat til nitrit og måle total nitrit og nitrat (undertiden benævnt som NOx) indhold i prøven. Sande nitrat værdi er forskellen af ​​begge målinger. Bedre alternativ til denne to trin protokol er forudgående separation af nitrit og nitrat ved kromatografi. Men dette betydeligt nedsætter følsomheden og øger analysetiden.

Fremtidige applikationer

Med voksende beviser om betydningen af ​​NO vej hos biologisk system, forudser vi hyppigere brug af nitrit eller nitrat eller andre NO metabolitter som biomarkører for hjerte-kar-sundhed. Øget tyder også, at disse molekyler kan være vigtige i motion medicin og deres niveauer kan ændres i mennesker med diabetes, fedme og metabolisk syndrom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Alan Schechter er opført som en co-opfinder på adskillige patenter udstedt til National Institutes of Health for brug af nitrit salte til behandling af hjerte-karsygdomme. Han modtager royalties baseret på NIH licensering af disse patenter til klinisk udvikling, men ingen anden kompensation.

Acknowledgments

Forfattere ønsker at anerkende kritiske bidrag Dr. A. Dejam og MM Pelletier i udviklingen af ​​brugen af ​​nitrit bevare løsning for nitrit målinger i blodet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 Sigma 702587
NEM; N-ethylmaleimide Sigma 4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385
sulfanilamide; AS  Sigma S9251
HCl Sigma H1758
acetic acid, glacial Sigma A9967
ascorbic acid  Sigma A7506
potassium iodide; KI Sigma 60399
iodine; I2 Sigma 207772 light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2 Sigma 563218
vanadium(III) chloride; VCl3 Sigma 208272 ligt sensitive, toxic
GentleMac Miltenyi
Sievers NOA 280i GE
CLD 88Y  Ecophysics 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
  2. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
  3. Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).
  4. Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
  5. Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
  6. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
  7. Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
  8. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
  9. Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104, (5), 538-543 (1997).
  10. Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
  11. Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
Måling nitrit og nitrat, metabolitter i Nitrogenoxid Pathway, i biologisk materiale ved hjælp af Chemiluminescence Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).More

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter