Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Måling nitritt og nitrat, metabolitter i nitrogenoksid Pathway, i biologisk materiale ved hjelp av Chemiluminescence Method

doi: 10.3791/54879 Published: December 25, 2016

Abstract

Nitrogenoksid (NO) er en av de viktigste regulator molekylene i vaskulær homeostasis og også en nevrotransmitter. Enzymatisk produsert NO oksideres til nitritt og nitrat ved interaksjoner med ulike oksygen-heme proteiner og andre fortsatt ikke kjente veier. Den omvendte prosessen, reduksjon av nitritt og nitrat til NO hadde blitt oppdaget hos pattedyr i det siste tiåret, og det er å få oppmerksomhet som en av de mulige veier å enten forebygge eller lindre en rekke hjerte, metabolske og muskelsykdommer som antas å være assosiert med reduserte nivåer av NO. Det er derfor viktig å estimere mengden av NO og dets metabolitter i forskjellige kroppsrom - blod, kroppsvæsker og de forskjellige vev. Blod, på grunn av sin lett tilgjengelighet, er den foretrukne rommet benyttes for estimering av NO metabolitter. På grunn av sin korte levetid (noen få millisekunder) og lav sub-nanomolar konsentrasjon, direkte målinger av blod ingen pålitelig <em> in vivo bød på store tekniske problemer. Dermed NO tilgjengelighet er vanligvis beregnet basert på mengden av sin oksidasjonsprodukter, nitritt og nitrat. Disse to metabolitter alltid måles separat. Det er flere godt etablerte metoder for å bestemme deres konsentrasjoner i biologiske væsker og vev. Her presenterer vi en protokoll for kjemiluminescens-metoden (CL), basert på spectrophotometrical deteksjon av NO etter nitritt eller nitrat reduksjon med tri-jodid eller vanadium (III) klorid-løsninger, respektivt. Følsomheten for nitritt og nitrat påvisning er i lav nanomolar rekkevidde, som setter CL som den mest sensitive metoden for tiden tilgjengelig for å bestemme endringer i NO stoffskifte. Vi forklarer i detalj hvordan du skal forberede prøver fra biologiske væsker og vev for å bevare opprinnelige mengder nitritt og nitrat til stede på tidspunktet for innsamling og hvordan å bestemme deres respektive mengder i prøver. Begrensninger av CL teknikken er også explained.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nitritt, og til en mindre forlenge nitrat-nivåer i blod reflektere generelle tilstanden av kropps NO metabolisme. Nitritt konsentrasjoner i blodet og i de fleste organer og vev er bare i høy nanomolar eller lavt mikromolområde, er vanligvis til stede i mye større mengder nitrat - i mikromolområde. Endringer i nitritt nivåer på grunn av sykdomsprogresjon eller endringer i kostvaner er ganske små og kan bare måles ved hjelp av en svært følsom metode. På grunn av deres svært ulike nivåer og ulike metabolske prosesser, er separat bestemmelse av nitritt og nitrat nivåer avgjørende. Såkalte "NO x vilje", der nitritt og nitrat blir målt sammen har svært liten verdi.

Flere fremgangsmåter for å kvantifisere nitritt i forskjellige biologiske prøver har blitt utviklet - de vanligste er den eldste, basert på Griess-reaksjonen som ble opprinnelig beskrevet i 1879. Selv med moderne modifications, er følsomheten grense for nitritt oppnåelig ved Griess 'metode i lavt mikromolområde. Kjemiluminescens (CL), kombinert med tri-jodid reduserende oppløsning, blir for tiden betraktet som den mest følsom metode, slik at kvantifisering i det lave nanomolare området av nitritt konsentrasjoner 1-8,10,11. Den samme fremgangsmåte CL, kombinert med vanadium (III) klorid reduserende oppløsning, kan anvendes for sensitive målinger av nitrat, med presisjon i det nanomolare området 9.

CL oppdager fri gass NO. Derfor nitritt, nitrat, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosoaminer (R-NSFs), eller metall-NO forbindelser (senere i manuskriptet omtalt som "R- (X) -INGEN"), må konverteres til gratis ingen gass for å kvantifisere sine opprinnelige mengder via CL. Omdannelse til NO oppnås ved hjelp av flere forskjellige reduserende løsninger, avhengig av innholdet av NO-metabolitten. Etter konvertering, er gratis NO gass fjernes fra reaksjonsbeholderen av en bæregass (He, N2 eller Ar) inn i reaksjonskammeret av CL-analysator hvor ozon (O3) er kombinert med NO under dannelse av nitrogendioksid (NO2) i sin aktiverte tilstand. Med retur til grunntilstanden, NO 2 * avgir infrarød regionen og slippes foton blir oppdaget av photomultiplier (PMT) av CL instrument. Intensiteten av emittert lys er direkte proporsjonal med NO-konsentrasjon i reaksjonskammeret, noe som tillater beregning av den konsentrasjon av den opprinnelige arter ved hjelp av egnede kalibreringskurver.

I vår protokoll, vi først stede CL-basert bestemmelse av nitritt og nitrat i de mest brukte kliniske settinger - i blod og plasma, og da vi diskutere hvordan å bestemme disse ionene i vevsprøver. Vi forklarer også i detalj hvordan å bevare den opprinnelige fysiologiske nitritt-konsentrasjonen i nitritt-reaktive miljøer, for eksempel blod og dets avdelinger, plasma og røde blodceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle protokoller, inkludert bruk av dyr ble godkjent for bruk av NIDDK Animal Care og bruk komité og menneskeblod ble hentet fra NIH Blood bank fra friske givere.

1. Prøvepreparering

  1. Utarbeidelse av nitritt bevare løsning
    1. Fremstille en oppløsning inneholdende 890 mM kaliumferricyanid (K 3 Fe (CN) 6), og 118 mM NEM (N-etylmaleimid) i destillert vann. Løs opp godt før det er klart gul med krystaller stede. Legg NP-40 (oktyl phenoxylpolyethoxylethanol) i en 1: 9 forhold (v / v NP-40 / løsning). Bland forsiktig for å unngå skumming og oppbevar ved 4 ° C i ca en uke).
  2. Innsamling og forberedelse av blodprøver
    1. Samle opp blod ved hjelp av minst en 20 G nål for å unngå hemolyse med heparin for å forhindre koagulering (5 U / ml). For hele blodprøven, blandes blodet med nitritt bevare oppløsning umiddelbart i et 1: 4-forhold (v/ V løsning / blod).
    2. For plasma og røde blodceller prøver, sentrifuger oppsamlet blod i 5 min ved 4000 x g ved 4 ° C for å separere røde blodceller (RBC) og plasma. Ta den overliggende væske (plasma) og blande det med nitritt bevare løsning som er beskrevet ovenfor for bestemmelse av nitritt-nivåer i plasma.
    3. nøye fjerne gjenværende plasma og buffy coat fra prøven og pipetten RBC prøve fra bunnen av røret for å unngå forurensning av andre typer blodceller ved hjelp av en cut-off pipettespissen, og overføre den til et rør inneholdende nitritt bevare oppløsning i det samme forholdet som ovenfor.
    4. Bland hver prøve (plasma og RBC) med kald metanol i et forhold på 1: 1 eller 1: 2 (v / v sample / metanol) og sentrifuger dem ved 13.000 xg ved 4 ° C i 15 minutter for å utfelle proteiner. Ta supernatanten og bruke det til nitritt måling eller fryse fremstilte prøver, om nødvendig, på tørris og oppbevares ved -80 ° C.
      Merk: Nitritt raskt reaCTS med oxyhemoglobin (oxyHb) i bloddannende nitrat. Siden oxyHb er alltid til stede i stort overskudd i forhold nitritt, fører denne reaksjon til nesten fullstendig utslettelse av nativt blod nitritt med en tidsramme på ~ 10 min. For å bevare mest mulig av endogent blod nitritt, blir nitritt bevarende løsning tilsatt til prøver av fullblod umiddelbart etter blodprøvetaking. Løsningen blir hurtig lysering av røde blodceller og oksydere oxyHb til methemoglobin (MetHb), en inaktiv form av hemoglobin som ikke reagerer kjemisk med nitritt.
  3. Fremstilling av prøver fra andre typer av kroppsvæske
    1. Etter prøvetaking i egnet beholder, bland godt med nitritt bevare løsning, deproteinate og måle umiddelbart eller fryses og oppbevares ved -80 ° C.
  4. Innsamling og utarbeidelse av vevsprøver
    1. Samle vev fra dyr perfusert med heparinisert saltoppløsning (10 U heparin / ml). Vesenet om en g ønsket vev og homogen bruker en manuell homogenisator eller en automatisert homogenisator.
    2. Legg til en kjent mengde av nitritt bevare oppløsning som er nødvendig for å oppnå jevn homogenat.
    3. Når vevet er homogenisert, utfelles proteinene ved hjelp av kald methanol (1: 1 eller 1: 2-forhold volum / volum sample / metanol), som beskrevet ovenfor, deretter sentrifugeres prøvene ved 13 000 xg ved 4 ° C i 15 min.
    4. Samle supernatanten og måle nitritt nivåer. Hvis det er nødvendig, fryse prøver på ethvert stadium av forberedelser på tørris og oppbevares ved -80 ° C.

2. Fremstilling av reduserende løsninger

  1. Tri-jodid (I 3) reduserende løsning for nitritt og R- (X) -NO art bestemmelse 1,3,4
    1. Forbered en løsning av 301 mM KI sammen med 138 mM jeg to oppløsning i vann. Bland med iseddik i 2: 7-forhold (volum / volum løsning / syre) på en magnetisk rører i ~ 30 minutter inntil allKrystallene ble oppløst. Helst holde i mørk flaske, som jod er lyssensitiv, og bruk innen en uke fra forberedelse.
      Merk: Denne løsningen vil redusere nitritt til NO og det vil også frigjøre NO fra R-SNO, R-NSF og Fe-no funksjonelle grupper (R- (X) -INGEN), men nitrat vil ikke bli berørt. Signalet fra de ovenfor NO baserte funksjonelle grupper kan skilles fra ekte nitritt signal ved behandling av halvparten av prøven med surgjort sulfanilamid (AS) og å sammenligne AS-behandlede og ubehandlede signal. AS irreversibelt danner diazonium kation med nitritt, og dette komplekset kan ikke reduseres ved I 3 oppløsning. For AS behandling, forberede 290 mM løsning av sulfanilamide i 1 M HCl og legge den til en delmengde av prøven i forholdet 1: 9 (v / v AS / prøve). Mål CL signal i AS-behandlede og ubehandlede deler av prøven. Å beregne den sanne nitritt signal som en forskjell fra AS-behandlede og ubehandlede del av prøven. Nitritt kan også måles ved hjelp av en selektiv nitrite-reduserende løsning av askorbinsyre / eddiksyreblanding som beskrevet i del 2.2. Men på grunn av den normalt lille mengde av R- (X) -NO arter tilstede, målinger ved hjelp av AS-ubehandlede prøver er i de fleste tilfeller en meget god tilnærming av den totale nitrittinnhold.
  2. Askorbinsyre / eddiksyre (4A) løsning for selektiv bestemmelse av nitritt 2
    1. Forbered 500 mM askorbinsyre i vann. Blandes med iseddik i forholdet 1: 7 (v / v, askorbinsyre / eddiksyre) for å fremstille reaksjonsblandingen.
      Merk: Denne løsningen er spesifikk for nitritt, vil ikke frigi NO fra en hvilken som helst R- (X) -NO arter eller nitrat. Imidlertid må oppløsningen av askorbinsyre og eddiksyre fremstilles friskt hver dag før målingene, som askorbinsyre lett oksiderer i oppløsning.
      Gjennomføring av nitritt reduksjon avhenger av askorbinsyre konsentrasjon; og minst 50 mM askorbinsyre er anbefalt for fullstendig reduction av plasma nitritt. Imidlertid er det anbefalt å utføre noen pilotforsøk med ulike konsentrasjoner av askorbinsyre og nitritt standarder i det forventede nitritt konsentrasjonsområdet før endelig prøvemålinger. Husk at askorbinsyre litt utarmer under målingene, er så hyppige endringer av reaksjonsblandingen i glasset reaksjonskammeret anbefales.
  3. Vanadium (III) klorid redusere løsning for nitrat besluttsomhet 9
    1. Forbered 51 mM løsning av VCL 3 i 1 M HCl. Filtrer løsningen gjennom 200 um filter og oppbevar i en mørk flaske, bruker i løpet av to uker.
      Merk: Denne løsningen vil redusere nitrat, nitritt og alle R- (X) -INGEN arter, så hvis sammenlignbare mengder nitritt eller annen R- (X) -INGEN arter er til stede sammen med nitrat, har det endelige nitratinnhold skal beregnes som differansen mellom de signaler som oppnås med CL VCL 3 og jeg3 reduserer løsninger.

3. Chemiluminescence (CL) Analyzer Setup og Målinger

  1. standardløsning
    1. Forbered 1fiM løsning av natriumnitritt (Nano 2). Den samme løsning kan brukes til nitritt og nitrat-bestemmelser.
  2. Bruke NO analysator
    Merk: For tiden er det to kommersielt tilgjengelige INGEN analysatorer som er følsomme nok for biologiske forskningsformål - Sievers NOA og Ecophysics CLD 88Y. De opererer begge på samme prinsipp; Hovedforskjellen er at CLD 88Y bruker oksygen fra romluften for å gjøre ozon (O 3), mens NOA krever en ekstern oksygentank for dette formål. Prosedyren nedenfor beskriver satt opp for Sievers NOA.
    1. instrument oppsett
      1. Utføre første satt opp av NO analysatoren i henhold til produsentens anbefalingersom vist på figur 1.
      2. Åpne O 2 tank koblet til instrumentet. Velg "analyse" og "enter" fra hovedmenyen på frontpanelet. På neste skjerm velger du "start" og trykk "enter". Koble syren felle (inneholdende 1 M NaOH) til apparatet som vist i figur 1.
      3. Vent til fotomultiplikatoren avkjøles til temperaturer under -12 ° C og reaksjonskammeret evakueres til 6 Torr. Det tar ca 30 min å nå en stabil flate baseline. Grunnlinjen må stabiliseres innen 1-2 mV, er mindre viktig enn dens stabilitet pålydende.
        Merk: Hvis nitrat måles, skru på kjøle vannbad (innstilt på 4 ° C, som tjener som kuldefelle for syre og vanndamp) og oppvarming vannbad (hovedreaksjonskammeret, 95 ° C). Hastigheten for reduksjon av nitrat til NO i VCL 3 oppløsning er temperaturavhengig, og det er meget langsom ved værelses temperatur, er så betydelig økning av temperaturen som behøves for å observere reaksjonen.
      4. Han åpner tanken og koble den glass-reaksjonskammeret for å felle syren som vist på figur 1. Fylle reaksjonskammeret med passende reduserende oppløsning, reduserer boblende til minimum og koble reaksjonskammeret til syren felle. Ved hjelp av prøving og feiling, juster den boblende hastighet han for å passe instrument sugehastigheten (vanligvis ~ 200 ml / min for Siever s NOA).
      5. Slår på datamaskinen styre instrumentet og start Labview-baserte flytende programvare. Slik slår du på kommunikasjon mellom instrument og oppkjøpet programvare, trykk "enter" når du er i "data-menyen" inntil skjermen leser "output aktivert", og trykk deretter på "klar" for å returnere tilbake til dataskjermen.
      6. Vente på en stabil basislinje spor på skjermen, og begynner å injisere prøver og standarder nitritt til å redusere oppløsningen gjennom septum. Alltid vente å nå en stabil baseline akteruter topp. Dette kan ta opp til 2 min. Liquid programvare har en opsjon på å "merke" tider av injeksjon og kommentere injeksjon og det vil eksportere disse kommentarene i en egen fil (filename.info) som et nyttig supplement til datafilen (filename.data).
      7. Når prøver og standarder er målt, velg "stopp" i Liquid programvare menyen - dette vil skrive data fra en midlertidig fil til en permanent fil kalt "filename.data". Ved å trykke "avbryt" alternativet vil avslutte målingen uten å skrive innsamlede data til en permanent fil.
      8. For å avslutte forsøket, må du koble maskinen fra reaksjonsbeholderen ved å slå av stoppekran på toppen av reaksjonsbeholderen og koble slangen mellom syre felle og reaksjonsbeholderen (se figur 1). Nå stopper NOA analysator - trykk "klar", gå til "analyse", sette maskinen i "standby" og "bekrefte" standby. Hvis det brukes regelmessig,Instrumentet kan stå i standby-modus for flere uker. Slå av tilførsel av oksygen. Deretter skylle redusere oppløsningen fra reaksjonskammeret, koble og lukker han tanken fra glassreaksjonsbeholderen og ferdig med rengjøring reaksjonsbeholder.
    2. Standarder og prøve injeksjoner
      1. Injiser 50 ul av 1 pM nitrittoppløsning inn i reaksjonsblandingen ved hjelp av en godt vasket Hamilton sprøyte. Vent i minst 1 - 2 minutter mellom injeksjoner for å oppnå god separasjon av topper. Gjenta injeksjon av 50 ul for å få duplikater til hvert datapunkt. Vask sprøyte med avionisert vann etter hver injeksjon.
      2. For å skaffe et komplett sett av data for standardkurven, fortsette med like injeksjoner av 100, 150 ul (ytterligere 200 ul kan være nødvendig dersom høye konsentrasjoner av nitritt eller nitrat er forventet) av 1 uM nitrittløsning. I hvert tilfelle, ta vare å vente til signalet faller tilbake til grunnlinjen, og deretter skaffe 1 - 2 min av baseline for å oppnå god separasjon av toppene.
        Merk: Nitrit standarder kan måles når som helst i løpet av eksperimentene. Det er imidlertid foretrukket å skaffe standardkurven før datamålingen, som det også fungerer som en uavhengig kontroll av instrument funksjonalitet.
        Når data blir samlet inn, injisert mengde prøve bør føre til godt markerte topper. Det bør imidlertid tas i betraktning at fotomultiplikatoren er lineær bare opp til ~ 800 mV, slik at ingen av toppen bør være høyere enn ~ 700 mV. Dette kan oppnås enten ved å redusere mengden av injisert prøve eller fortynning av prøven med deionisert vann. Hvert punkt bør måles i det minste i duplikat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figur 2 viser representative resultater innhentet fra standarder og fem forskjellige prøver. Som vist i denne figur, fotomultiplikatorer spenningen øker umiddelbart etter nitritt-inneholdende oppløsning (standarder eller prøver) blir injisert inn i reduserende oppløsning (injeksjonstider er angitt med røde pilene under kurven) og går tilbake til grunnlinjeverdien når alle nitritt er tilstede i den injiserte oppløsningen ble redusert. Det er også klart fra denne figuren at nøyaktige volummålinger er nødvendig for å oppnå meget reproduserbare data. Vi anbefaler å bruke presisjons Hamilton sprøyter for å måle injeksjonsvolumer. Tap av reduserende kapasitet av I 3 (eller askorbinsyre eller VCL 3) oppløsning er en annen vanlig kilde til feil. Som en generell regel, når baseline bredde av toppene begynner å utvide seg betydelig, noe som reduserer oppløsningen i reaksjonskammeret må endres. Bredden av toppen er avhengig av gasstrømmen inn i NO-Et reaksjonskammer (merket som RC på figur 1), og den svakt varierer fra en eksperimentell oppstilling til en annen. Vi anser den normale bredde til å være omkring 1 minutt for nitritt målinger og opp til 2 min for nitrat målinger.

For å kunne relatere signalet fra fotomultiplikator med mengden av NO detektert, blir en standardkurve konstruert som en plotting av arealet under toppen og mengden av nitritt (i pmol) injisert som vist på figur 3A. For å måle arealet under toppen hvilken som helst egnet programvare kan anvendes, slik som Origin, Excel eller lignende. Helningen av denne kurven, K (merket med rødt i figur 3B), gir mengden av pmol av NO forårsaker økning av 1 mV fra fotomultiplikator (PM) signal. Fordelen med å bruke helningen av kurven, snarere enn arealet under toppen som er relatert til fast mengde av NO, er økt nøyaktighet. Standardkurven er konstruert av minst tre forskjelligepunkter, idet hver av dem blir målt i duplikat og hvis det er noen gjenværende nitritt eller nitrat i vannet som brukes til å fremstille standardløsningen, ved hjelp av K eliminerer nødvendigheten av rettelser til disse restmengder. Også, etter våre første tester av NOA instrument for sin PM linearitet, fant vi ut at lineær respons oppstår opp til 700-800 mV. Derfor er vår standardkurve gjelder for alle signaler fra prøvene opp til denne PM-serien. Linearitet Rekkevidden avhenger av PM og kan endre seg med tiden. Det må bestemmes før instrumentet tas i bruk og testet som PM aldre hver par år.

Data som samles inn fra prøvene blir behandlet på lignende måte som data som er samlet for standardkurve: Først arealet under toppen blir bestemt. Da dette området blir dividert med helningen K av standardkurven, som gir antall pmol av NO stammer fra mengden av injiserte prøven.

figur 3B. Data blir så plottet på samme måte som eksemplet i figur 3B. I det eksempel som er gitt i figur 3B plottet vi resultatene fra 5 separate prøver er vist i panel A. Her plotter vi gjennomsnittsverdier fra 2 injeksjoner og gi SD for å vise reproduserbarheten av de enkelte punktmålinger.

For prøvene i figur 3, S1, S2 og S4 er rotte blod og S3 og S5 rottelever. Figur 3C viser de endelige resultatene plotte sammen med SD og uttrykt i nM (for blod, n = 3) eller pmol / mg vev (for leveren, n = 2).

Figur 1
Figur 1: Oppsett av Sievers NOA Chemiluminescence Instrument. Reaksjonskaret er fylt med I 3 (askorbinsyre / eddiksyre eller VCL 3) oppløsning med Han bærergass forsiktig boblet gjennom. Prøven injiseres med Hamilton sprøyte gjennom septum til jeg tre løsning der ingen relaterte komponenter er redusert til NO gass og båret inn NO analysator. Cold felle, NaOH fylt felle, og filter beskytter analysatoren mot fuktighet og syredamp. I reaksjonskammer (RC) NO gass er kombinert med O 3 (generert i O 3 generator) fra oksygen fra O 2 tank. Kjemiluminescens-signalet fra NO 2 * detekteres av fotomultiplikatorrøret (PMT) og ytterligere forsterket og behandlet. Datainnsamling og analyse er utført på PC. Støvsuger pumpelaget lavt trykk i reaksjonskammeret (RC) og evakuerer giftig NO 2 gassen etter kjemiluminescens måling gjennom kullfilteret (KF). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Representant Plot av NO topper generert av CL. Dette diagrammet viser den fotomultiplikatoren (PMT) signal som en funksjon av tid. Topper resultat av injeksjoner av forskjellige mengder av 1 pM nitrittløsning (standarder) og 100 ul av prøver (S1 - S5) injisert i duplikater og tre eksemplarer (50 ul av nitritt standardløsning). Røde piler under kurven indikerer tider av injeksjoner. Klikk her for å se et laRger versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3: Standard Curve (A) og Representative Resultater fra Rat blod og lever (B), Sluttresultater Plot (C). Standardkurve (panel A) ble oppnådd ved å injisere 50, 100 og 150 pl av 1 pM nitritt-oppløsning i vann, å måle arealet under toppene. Skråningen, K (red nummer) gir nmol av NO som kreves for en 1 mV økning i fotomultiplikator spenning. Opprinnelige topper som brukes for standardkurve er i figur 2 og er merket som 50, 100 og 150 ul. Figur 2 viser også de originale injeksjoner for våre prøver - S1, S2 og S4 (mørk grå) fra rotte blod, S3 og S5 fra rotte levervev, alt injisert i to eksemplarer. Arealet under disse toppene ble målt, og, etter at alle korreksjoner for fortynninger ble laget som beskrevet i del 3.2.1., Results vist i panel B for de enkelte prøver ble beregnet som mengden av nitritt i pmol / g lever eller i nM for blod. For å verdsette reproduserbarheten av kjemiluminescens-metoden, plottet vi gjennomsnittet og standardavvik for hver enkelt prøve. Panel C viser den endelige produktene nitritt og nitrat i rotte blodet og leveren plottet som gjennomsnitt av tre individuelle prøver for blod og to for leveren sammen med standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kritiske trinn i protokollen

Porsjoner av alle løsninger (inkludert vann) som brukes til å tilberede, utvanning eller på annen måte behandle originale prøvene må lagres og sjekkes for mulig nitritt eller (oftere) nitrat forurensning. Vi fant at de fleste forurensning kommer fra vann og mange kjemikalier som brukes til å behandle prøven (ferricyanide spesielt) også inneholde betydelige mengder nitrat forurensning i noen masse som forstyrrer den endogene nitrat besluttsomhet. Vi sjekker derfor alle våre kjemikalier for nitritt og nitrat forurensninger før vi bruker dem i vanlig eksperiment.

Siden prøver kan bli utsatt for betydelige fortynninger flere ganger under behandling, alle prøve manipulasjoner trenger å bli dokumentert for sluttkonsentrasjon beregninger. De fleste feil er gjort i denne del av protokollen.

Ved håndtering av prøver for nitritt målinger, rask overføring tilnitritt bevare løsning er avgjørende, spesielt når heme-inneholdende proteiner, slik som hemoglobin, som reagerer med nitritt og oksiderer det til nitrat, er til stede. Når stabilisert, kan prøvene fryses for langvarig lagring før analyser.

Mengder av flere NO metabolitter i biologiske prøver (spesielt RX-NO) er svært lav, noen ganger nivåene av genererte NO er ​​i bakgrunnsstøynivået i NOA analysatoren. Det er alltid foretrukket å fremstille prøver med så liten fortynning som mulig om slike forbindelser skal måles.

Begrensninger av teknikken

Med forsiktig prøveopparbeidelse og injeksjoner, den lave grensen for følsomhet er nær 20 nM av NO addukt stede i fullt forberedt prøven. De vanlige biologiske konsentrasjoner av nitritt og nitrat ikke overskrider disse konsentrasjoner har imidlertid R- (X) -NO mengder kan falle i nærheten av dette område.

CL høye senfølsomheten krever forsiktig prøveopparbeidelse og presise volummålinger.

Betydningen av CL i forhold til alternative metoder for Ingen metabolitter Målinger

Kjemiluminescens (CL) er en meget følsom metode for å detektere NO, nitritt, nitrat og RX-NO. Foreløpig er CL regnet som gullstandarden i fastsettelse av NO og dets metabolitter.

Andre vanlige alternativ for å bestemme nitritt er Griess-reaksjonen (GR). GR er en bekvem og rimelig kolorimetrisk metode basert på diazotering reaksjon er beskrevet av Peter Griess i 1879. Analyse av nitrat krever forutgående kjemisk eller enzymatisk reduksjon av nitrat til nitritt. Beste dagens kommersielt tilgjengelige kits har følsomhet rundt 100 nM for nitritt, følsomhet i de fleste kits tillater å bestemme nitrat og nitrat er i lav mikrometer rekkevidde. Ved bruk av GR å bestemme nitritt og nitrat i prøven, er to trinn kreves; først, bestemme nitritt amount i første delmengde av prøven, og deretter bruke andre prøve for å redusere nitrat til nitritt og måle total nitritt og nitrat (noen ganger omtalt som NOx) innholdet i prøven. Sann nitrat verdi er differansen av begge målinger. Bedre alternativ til dette to trinn protokollen er forutgående separasjon av nitritt og nitrat ved kromatografi. Imidlertid reduseres dette betraktelig følsomhet og øker analysetiden.

fremtidige Applications

Med økende bevis om betydningen av NO sti i biologiske system, ser vi for oss det mer hyppig bruk av nitritt eller nitrat eller andre INGEN metabolitter som biomarkører for kardiovaskulær helse. Økt tyder også på at disse molekylene kan være viktig i øvelsen medisin og deres nivåer kan bli endret hos personer med diabetes, fedme og metabolsk syndrom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Alan Schechter er oppført som en co-oppfinner på flere patenter utstedt til National Institutes of Health for bruk av nitritt salter for behandling av hjerte- og karsykdommer. Han mottar royalties basert på NIH lisensiering av disse patentene for klinisk utvikling, men ingen annen kompensasjon.

Acknowledgments

Forfattere vil erkjenne kritiske bidrag fra Dr A. Dejam og MM Pelletier i å utvikle bruken av nitritt bevare løsning for nitritt målinger i blod.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 Sigma 702587
NEM; N-ethylmaleimide Sigma 4260
NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol Sigma 74385
sulfanilamide; AS  Sigma S9251
HCl Sigma H1758
acetic acid, glacial Sigma A9967
ascorbic acid  Sigma A7506
potassium iodide; KI Sigma 60399
iodine; I2 Sigma 207772 light sensitive, toxic
sodium nitrite; NaNO2 Sigma 563218
vanadium(III) chloride; VCl3 Sigma 208272 ligt sensitive, toxic
GentleMac Miltenyi
Sievers NOA 280i GE
CLD 88Y  Ecophysics 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
  2. Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
  3. Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).
  4. Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
  5. Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
  6. Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
  7. Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
  8. Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
  9. Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104, (5), 538-543 (1997).
  10. Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
  11. Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
Måling nitritt og nitrat, metabolitter i nitrogenoksid Pathway, i biologisk materiale ved hjelp av Chemiluminescence Method
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).More

Piknova, B., Park, J. W., Cassel, K. S., Gilliard, C. N., Schechter, A. N. Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method. J. Vis. Exp. (118), e54879, doi:10.3791/54879 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter