Mätning nitrit och nitrat, metaboliter i kväveoxid Pathway, i biologiskt material med hjälp av kemiluminescens metod
Summary
Nitric oxide (NO) is an important signaling molecule in vascular homeostasis. NO production in vivo is too low for direct measurement. Chemiluminescence provides useful insight into NO cycle via measuring its precursors and oxidation products, nitrite and nitrate. Nitrite / nitrate determination in body tissues and fluids is explained.
Abstract
Kväveoxid (NO) är en av de viktigaste regulatormolekyler i vaskulär homeostas och också en neurotransmittor. Enzymatiskt producerade NO oxideras till nitrit och nitrat genom interaktion med olika oxi-hem proteiner och andra ännu inte kända vägar. Den omvända processen, minskning av nitrit och nitrat till NO hade upptäckts i däggdjur under det senaste decenniet och det är få uppmärksamhet som en av de möjliga vägar för att antingen förhindra eller lindra en hel rad av kardiovaskulära, metaboliska och muskelrelaterade skador som tros vara associerad med minskade nivåer av NO. Det är därför viktigt att uppskatta mängden av NO och dess metaboliter i olika kropps fack – blod, kroppsvätskor och de olika vävnaderna. Blod, på grund av dess lätt tillgänglighet, är den föredragna fack som används för estimering av NO metaboliter. På grund av sin korta livstid (några millisekunder) och låg under nanomolar koncentration, direkta tillförlitliga mätningar av blod NO <em> In vivo nuvarande stora tekniska svårigheter. Således ingen tillgänglighet brukar uppskattas baserat på mängden av dess oxidationsprodukter, nitrit och nitrat. Dessa två metaboliter alltid mäts separat. Det finns flera väletablerade metoder för att bestämma deras koncentrationer i biologiska vätskor och vävnader. Här presenterar vi ett protokoll för kemiluminescens-metoden (CL), baserat på spectrophotometrical detektering av NO efter nitrit eller nitrat reduktion av tri-jodid eller vanadin (III) kloridlösningar, respektive. Känsligheten för nitrit och nitrat upptäckt är i låg nanomolära området, som sätter CL som den känsligaste metoden för närvarande tillgängliga för att bestämma förändringar i NO metaboliska vägar. Vi förklarar i detalj hur man förbereder prover från biologiska vätskor och vävnader för att bevara ursprungliga mängder nitrit och nitrat närvarande vid tidpunkten för insamling och hur man bestämmer deras respektive mängder i prover. Begränsningar av CL-tekniken är också expLained.
Introduction
Nitrit och till en mindre sträcka nitrat, i blodet återspeglar allmänna läget för kroppen NO metabolism. Nitritkoncentrationer i blodet och de flesta organ och vävnader är endast i hög nanomolära eller låga mikromolära området, är vanligtvis närvarande i mycket större mängder nitrat – i mikromolära området. Förändringar i nitritnivåer på grund av sjukdomsprogression eller förändringar i matvanor är ganska små och kan endast mätas med hjälp av en mycket känslig metod. På grund av sina mycket olika nivåer och olika metaboliska processer, är viktigt separat bestämning av nitrit och nitrat. Så kallade "NOx bestämningen", där nitrit och nitrat mäts tillsammans har mycket litet värde.
Flera metoder för att kvantifiera nitrit i olika biologiska prover har tagits fram – den vanligaste är den äldsta, baserat på Griess reaktion som hade ursprungligen beskrivits i 1879. Även med modern modifications, är låg mikromolära området känslighetsgränsen för nitrit uppnås genom Griess metoden. Kemiluminiscens (CL), i kombination med tri-jodid reducerande lösning, är för närvarande anses vara den mest känsliga metoden, vilket gör kvantifiering i det låga nanomolära området av nitritkoncentrationer 1-8,10,11. Samma CL-metoden, i kombination med vanadin (III) klorid reducerande lösning, kan användas för känsliga mätningar av nitrat, med precision i nanomolära området 9.
CL upptäcker fri gas NO. Därför, nitrit, nitrat, R-nitrosotioler (R-SNO), R-nitrosaminer (R-NNo), eller metall-NO föreningar (senare i manuskript kallat "R- (X) -NO"), måste omvandlas till gratis ingen gas för att kvantifiera sina ursprungliga belopp via CL. Omvandling till NO uppnås med hjälp av flera olika reducerande lösningar, beroende på naturen av NO-metaboliten. Efter konverteringen är gratis NO-gas avlägsnas från reaktionskärlet genom en bärgas (He, N2 eller Ar) i reaktionskammaren i CL analysator där ozon (O 3) kombineras med NO för att bilda kvävedioxid (NO 2) i sitt aktiverade tillstånd. Med återgång till grundtillståndet, NO2 * emitterar i infraröda området och utsända fotonen detekteras av fotomultiplikator (PMT) CL instrument. Intensiteten för emitterat ljus är direkt proportionell mot NO-koncentrationen i reaktionskammaren, vilket medger beräkning av koncentrationen av den ursprungliga arter med korrekta kalibreringskurvor.
I våra protokoll, vi först före CL-baserade bestämning av nitrit och nitrat i de mest använda kliniska – i blod och plasma och sedan diskuterar vi hur man kan bestämma dessa joner i vävnadsprover. Vi förklarar också i detalj hur man bevara den ursprungliga fysiologiska nitritkoncentrationen i nitrit reaktiva miljöer, såsom blod och dess fack, plasma och röda blodkroppar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i protokollet
Alikvoter av alla lösningar (inklusive vatten) som används för att förbereda, späda ut eller på annat sätt behandla ursprungliga prover måste sparas och kontrolleras för eventuell nitrit eller (oftare) nitratföroreningar. Vi fann att de flesta föroreningar kommer från vatten och många kemikalier som används för att behandla provet (ferricyanid i synnerhet) innehåller också en betydande mängd nitratföroreningar i vissa partier som stör den endogena…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill erkänna kritiska bidrag Dr A. Dejam och MM Pelletier i att utveckla användningen av nitrit bevara lösning för nitritmätningar i blodet.
Materials
| potassium ferricyanide; K3Fe(CN)6 | Sigma | 702587 | |
| NEM; N-ethylmaleimide | Sigma | 4260 | |
| NP-40; 4-Nonylphenyl-polyethylene glycol | Sigma | 74385 | |
| sulfanilamide; AS | Sigma | S9251 | |
| HCl | Sigma | H1758 | |
| acetic acid, glacial | Sigma | A9967 | |
| ascorbic acid | Sigma | A7506 | |
| potassium iodide; KI | Sigma | 60399 | |
| iodine; I2 | Sigma | 207772 | light sensitive, toxic |
| sodium nitrite; NaNO2 | Sigma | 563218 | |
| vanadium(III) chloride; VCl3 | Sigma | 208272 | ligt sensitive, toxic |
| GentleMac | Miltenyi | ||
| Sievers NOA 280i | GE | ||
| CLD 88Y | Ecophysics |
References
- Piknova, B., Schechter, A. N. Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay. Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).
- Nagababu, E., Rifkind, J. M. Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species. Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).
- Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E., Hancock, J. T. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction. 476, 11-28 (2008).
- Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions. Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).
- Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence. J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).
- Bryan, N. S., Grisham, M. B. Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples. Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).
- Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices. Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).
- Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples. Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).
- Smárason, A. K. 1., Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia. Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).
- Beckman, J. S., Congert, K. A. Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector. Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).
- Bates, J. N. Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection. Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).
