The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.
림프구는 다시 급속한 세포 증식, 이동 및 분화 및 사이토 카인 생산에 이르게 세포 내 신호 전달 경로를 활성화하여 자극의 다양한 반응한다. 이들 이벤트 모두는 밀접 전지의 에너지 상태에 연결되며, 따라서 에너지 생산 경로를 연구하는 것은 이들 세포의 전반적인 기능에 대한 단서를 제공 할 수있다. 세포 외 유동 분석기는 많은 세포 유형에서 해당 작용 및 미토콘드리아 호흡의 성능을 평가하기위한 일반적으로 사용되는 장치이다. 이 시스템은 몇 게시 된 보고서에서 면역 세포를 연구하는 데 사용되었습니다, 아직 림프구를 위해 특별히 최적화 된 포괄적 인 프로토콜이 부족하다. 림프구는 생체 조건에서 제대로 살아남을 깨지기 쉬운 세포이다. 때때로 림프구 서브 세트는 드문, 낮은 세포 수로 작업하는 것은 불가피하다. 따라서, 이러한 어려움을 해결하는 실험적인 전략이 필요합니다. 여기, 우리는 프로토콜을 제공즉, 림프 조직에서 실행 가능한 림프구의 신속한 분리를 허용하고, 세포 외 플럭스 분석기에서의 대사 상태의 분석. 또한, 우리는 다른 세포 밀도에서 여러 림프구 아형의 신진 대사 활동을 비교 하였다 된 실험의 결과를 제공합니다. 이러한 관찰 우리 프로토콜에도 낮은 세포 농도에서 일관 잘 표준화 된 결과를 달성하기 위해 사용될 수 있으며, 따라서, 면역 세포 대사 사건의 특성에 초점을 맞춘 미래 연구에서 다양한 애플리케이션을 가질 수 있음을 시사한다.
항원에 대한 면역 반응은 면역 활성화 및 면역 억제 사이의 긴밀하게 조절 균형이다. 면역 억제는 단순히 이러한 사건을 억제하므로 불필요한 면역 반응 1-6 방지에 중요한 반면, 면역 활성은 자극에 반응하여 신속하게 세포 증식 및 이동뿐만 아니라, 사이토 카인 생산, 항체 분비를 증가 식세포를 구동한다. 최근 연구에 직접 링크가 면역 세포의 활성화 상태 및 각종 대사 경로 (7)의 활성 사이에 존재하는 것으로 나타났다. 면역 세포 및 오프 에너지 생산 경로를 전환하여 휴식과 활성화 상태 사이를 전환 할 수 있습니다. 또한, 서로 다른 면역 세포 유형의 활성화 과정들이 증가 에너지 수요 연료를 다른 대사 전략을 사용할 수 있음이 관찰되었다. 예를 들어, 동시에 T 림프구의 활성화는 거의 8 당분 상태로 셀을 지시 </su> P는 활성화 된 B 림프구 및 산화 적 인산화 당분 9,10의 균형을 사용한다. 이러한 연구들은 세포 대사의 면역 세포 활성화 효과를 조사의 중요성을 지적한다.
실시간은 산화 적 인산화와 같은 당분 지표 산소 소모율 (OCR) 및 세포 외 산성화 속도 (ECAR) 동시 측정은 에너지 생산 경로 11-13의 상태를 해결하는 일반적인 방법이다. 이를 달성하기 위해, 예컨대 해마 XF 96 세포 외 유동 분석기는, 일상적으로 사용된다. 이러한 장비는 빠른 속도로 세포 유형에서 또는 다른 자극 조건에 OCR과 ECAR의 변화를 비교할 수 있습니다. 지금까지 면역 세포를 포함한 여러 세포 유형은 이러한 장치를 이용하여 연구되었다. 그러나, 특히 면역 세포 위해 설계된 최적화 된 프로토콜을 사용할 수 없습니다.
면역 세포, 특히 림프구, 오티 다를몇 가지 중요한 방법으로 그녀의 세포 유형. 림프구는 생체 조건 14-16 긴 기간 생존하지 않는 깨지기 쉬운 세포이다. 이것은 그들이 최적 성장 배지는 세포 유동 분석에 사용 된 것과 같은 필수 영양소를 결여에서 배양 더 큰 문제이다. 대 식세포 많은 세포주는 달리, 림프구는 플라스틱 표면에 부착하지 않는다; 따라서 스트레스를 생성하지 않고 분석 판에 첨부하는 것이 중요합니다. 마지막으로, 일부 림프구 소집단는 매우 드문 일 수 있으며, 필요한 최적의 양에 그들을 수확은 17-19 어려울 수 있습니다.
여기, 우리는 특히 림프구를 위해 개발 된 최적화 된 프로토콜을 제공합니다. 우리 differen 그들의 휴지 상태 및 산화 적 인산화 해당 작용의 특성을 표시 노드 (20), 마우스의 비장 및 림프절로부터 분리 된 비장 세포, B 림프구 및 나이브 CD4 + T 림프구를 사용하여T 세포 밀도. 데이터는 물론 세포 수에 정비례 하였다 최종 분석 파쇄 단백질 농도를 측정하여 각각의 초기 세포 수의 차이를 고려하여 표준화 하였다. 우리 프로토콜뿐만 아니라 세포 유동 분석을위한 가능한 림프구의 신속한 분리를위한 가이드 라인을 제공 할뿐만 아니라, 데이터의 품질을 손상시키지 않고 최적 세포 농도에서 작동 가능하다.
프로토콜은 우리는 이후 해당 작용 및 미토콘드리아 호흡 성능의 차이를 평가하기 위해 상이한 농도에서 세포 외 유동 해석에 사용 된 순수한 가능한 림프구 서브 세트의 효율적인 분리를 위해 허용 개발 하였다. 이 프로토콜은 림프구를 위해 특별히 설계된 낮은 기초 대사 활동, 취약성, 저주파 이러한 세포 유형에 관련된 특별 고려 사항을 해결하고, 자신의 무능력 분석 플레이트에 부착된다. 따라서, 이전에 게시 된 프로토콜 11, 12에 비해, 우리의 방법은 면역학의 분야에 종사하는 연구자에 대한 더 편리하고 더 나은 최적화 가이드를 제안합니다. 순수와 생존 세포 개체군을 얻는 최적 합류 세포를 도금하고, 각 웰의 단백질 농도로 세포 유동 분석 측정의 표준화를 포함하여,이 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가있다.
제 i모두는 광학 현미경에 의해 가시화 될 수있는 도금 셀 nitial 수는 단백질 농도를 측정하여 정량화 될 수있다. 세포 수 및 단백질 농도 간의 선형 상관 관계는 단백질 농도가 실제로 다른 웰 사이의 세포 수의 변화의 효과를 표준화하는 방법으로 사용될 수 있음을 확인 하였다.
단백질 농도로 ECAR 및 OCR 결과를 표준화함으로써 보여 것을 저급 셀 합류에도 불구하고, 거의 5 × 10 2.5 세포 / 웰의 데이터의 품질을 손상시키지 않으면 서 대부분의 분석에 사용될 수있다. 그러나, 세포 유형 분석 및 사이에서 변화 사용할 수있는 세포의 하한. 적은 수의 5 내지 10 X 125 세포와 같은 B 세포 OCR 측정도 2.5 × 105 세포 / 사용될 수 있지만 예를 들어,도 동일한 세포 유형의 당분 성능을 평가하기에 충분하지 않았다. 따라서, 한 세포 수는 제한 요인이 아니기 때문에 이상에 도금약 5 × 105 림프구에 해당하는 90 % 합류 / 웰 바람직하다. 또한 최적화가 요구 될 수있는 경우에 세포 크기가 다른 예 : 이전에 활성화 부분적으로 차별화 된 림프구가-되어 사용되는. 미리 배양 차 림프구를 사용하는 경우 또한, 죽은 사람 세포 수의 측정으로 단백질 농도의 신뢰성을 감소시킨다 다른 처리 조건과 세포 생존에 변형이있을 수 또는 죽어가는 세포는 또한 측정 된 단백질 수준에 기여 . 이러한 경우에, 세포 계측법 세포 외 플럭스 분석을 수행하기 전에 흐름으로 살아있는 세포를 정렬하는 데 도움이 될 수 있습니다.
갓 격리 높은 가능한 림프구 인구를 사용하여 우리의 분석에서, 우리는 모두 OCR 및 ECAR 측정을위한 신뢰할 수있는 기능 데이터를 얻을. 모든 세포 유형은 미토콘드리아 스트레스 테스트에 유사하게 동작하는 동안, 세포 유형 간의 현저한 차이가 있었다당분 스트레스 테스트에서 관측. 예를 들어, 나이브 T 세포의 당분 성능 또는 비장 B 세포에 비해 낮고, 그리고 oligomycin 첨가 변하지 않았다. 이러한 관찰 된 프로토콜의 유효성을 확인하기 이전에 발표 된 연구 7,30와 일치한다.
결론적으로, 우리의 방법은 세포 유동 분석기를 사용하여 림프구의 대사 활성을 테스트 효율적이고 편리한 방법을 제공하며, 이는 활성, 세포 분화 또는 인해시 면역 세포 대사의 변화를 탐색 면역 학적 연구의 넓은 범위에서 유용 감염,자가 면역 및 혈액 악성 종양과 같은 질병 표현형에.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Peña for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.
PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
0.5M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
L-Glutamine 200mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
Sodium pyruvate 100mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
HEPES 1M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis. |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak. |