The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.
लिम्फोसाइटों intracellular संकेत दे रास्ते, जो बारी में तेजी सेलुलर प्रसार, प्रवास और भेदभाव, और साइटोकाइन उत्पादन होता सक्रिय द्वारा उत्तेजनाओं की एक किस्म का जवाब। इन घटनाओं के सभी कसकर सेल की ऊर्जा स्थिति से जुड़े होते हैं, और इसलिए ऊर्जा के उत्पादन के रास्ते का अध्ययन कर इन कोशिकाओं के समग्र कार्यक्षमता के बारे में सुराग दे सकता है। बाह्य प्रवाह विश्लेषक कई प्रकार की कोशिकाओं में ग्लाइकोलाइसिस और mitochondrial श्वसन के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया उपकरण है। इस प्रणाली में कुछ प्रकाशित रिपोर्ट में प्रतिरक्षा कोशिकाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, अभी तक एक व्यापक प्रोटोकॉल लिम्फोसाइटों के लिए विशेष रूप से अनुकूलित कमी है। लिम्फोसाइटों नाजुक कोशिकाओं है कि पूर्व vivo परिस्थितियों में जीवित रहने के खराब कर रहे हैं। बार बार लिम्फोसाइट कैंपेन्स के दुर्लभ हैं, और कम सेल नंबर के साथ काम करना अनिवार्य है। इस प्रकार, एक प्रयोगात्मक रणनीति है कि इन कठिनाइयों के पते की आवश्यकता है। यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैंकि बाह्य प्रवाह विश्लेषक में उनके चयापचय राज्यों के विश्लेषण के लिए लसीकावत् ऊतकों से व्यवहार्य लिम्फोसाइटों के तेजी से अलगाव के लिए अनुमति देता है, और। इसके अलावा, हम जो में अलग सेल घनत्व में कई लिम्फोसाइट उपप्रकार के चयापचय गतिविधियों की तुलना में थे प्रयोगों के परिणामों प्रदान करते हैं। इन टिप्पणियों का सुझाव है कि हमारे प्रोटोकॉल भी कम सेल सांद्रता में संगत, अच्छी तरह से मानकीकृत परिणाम प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और इस प्रकार यह भविष्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं में चयापचय की घटनाओं के लक्षण वर्णन पर ध्यान केंद्रित अध्ययन में व्यापक आवेदन कर सकते हैं।
एंटीजन के खिलाफ प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया प्रतिरक्षा सक्रियण और प्रतिरक्षा दमन के बीच एक कसकर विनियमित संतुलन है। प्रतिरक्षा सक्रियण उत्तेजक के जवाब में तेजी से सेल प्रसार और प्रवास, साथ ही साइटोकाइन उत्पादन, एंटीबॉडी स्राव और बढ़ phagocytosis ड्राइव, जबकि प्रतिरक्षा दमन बस इन घटनाओं को रोकता है और इसलिए अनावश्यक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 1-6 को रोकने में महत्वपूर्ण है। हाल के अध्ययनों से पता चला है कि एक सीधा लिंक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की सक्रियता की स्थिति और विभिन्न चयापचय मार्ग 7 की गतिविधि के बीच मौजूद है। प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर और बंद ऊर्जा के उत्पादन के रास्ते बंद करके आराम और सक्रिय राज्यों के बीच बदलाव कर सकते हैं। इसके अलावा, यह देखा गया है कि विभिन्न प्रकार के प्रतिरक्षा सेल सक्रियण के दौरान उनके वृद्धि की ऊर्जा जरूरतों को ईंधन के लिए विभिन्न चयापचय रणनीतियों का इस्तेमाल कर सकता है। उदाहरण के लिए, जबकि टी lymphocytes की सक्रियता के एक लगभग पूरी तरह से glycolytic राज्य 8 में कोशिकाओं का निर्देशन </sup>, सक्रिय बी लिम्फोसाइट ग्लाइकोलाइसिस और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण 9,10 के एक संतुलन का उपयोग करें। ये अध्ययन सेलुलर चयापचय पर प्रतिरक्षा सेल सक्रियण के प्रभाव की जांच के महत्व को इंगित करते हैं।
वास्तविक समय है, ऑक्सीजन की खपत दर (ओसीआर) और बाह्य अम्लीकरण दर (ECAR), आक्सीकारक फास्फारिलीकरण और ग्लाइकोलाइसिस के संकेतक के रूप में एक साथ माप, एक आम रणनीति ऊर्जा के उत्पादन के रास्ते 11-13 के राज्यों को संबोधित करने के लिए है। इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, इस तरह के Seahorse एक्सएफ 96 के रूप में एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक, नियमित रूप से प्रयोग किया जाता है। इस तरह के एक उपकरण के तेजी से सेल प्रकार भर में या अलग उत्तेजना की स्थिति पर ओसीआर और ECAR में परिवर्तन तुलना कर सकते हैं। अब तक, प्रतिरक्षा कोशिकाओं सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, इन उपकरणों का उपयोग कर अध्ययन किया गया है। हालांकि, एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विशेष प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए डिजाइन उपलब्ध नहीं है।
प्रतिरक्षा कोशिकाओं, विशेष रूप से लिम्फोसाइट, ओटी से अलगकई महत्वपूर्ण मायनों में उसकी प्रकार की कोशिकाओं। लिम्फोसाइटों नाजुक कोशिकाओं है कि पूर्व vivo की स्थिति 14-16 में लंबी अवधि के लिए जीवित नहीं कर रहे हैं। यह उससे भी बड़ा मुद्दा है जब वे सबऑप्टिमल विकास मीडिया में इस तरह के बाह्य प्रवाह विश्लेषण में इस्तेमाल उन लोगों के रूप में आवश्यक पोषक तत्वों, कमी में संवर्धित कर रहे है। मैक्रोफेज और कई सेल लाइनों के विपरीत, लिम्फोसाइट प्लास्टिक की सतहों का पालन नहीं करते; इसलिए यह तनाव पैदा करने के बिना विश्लेषण थाली करने के लिए उन्हें संलग्न करने के लिए महत्वपूर्ण है। अंत में, कुछ लिम्फोसाइट उप-जनसंख्या अत्यंत दुर्लभ हो सकता है और उन्हें आवश्यक, इष्टतम मात्रा में फसल कटाई के चुनौतीपूर्ण 17-19 हो सकता है।
यहाँ, हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल है कि विशेष रूप से लिम्फोसाइटों के लिए विकसित की है प्रदान करते हैं। Splenocytes, बी लिम्फोसाइट और भोले सीडी 4+ टी लिम्फोसाइटों माउस प्लीहा और लिम्फ से अलग 20 नोड्स, हम differen में उनके आराम राज्य ग्लाइकोलाइसिस और आक्सीकारक फास्फारिलीकरण की विशेषताओं को दिखाने का प्रयोगटी सेल घनत्व। डेटा अच्छी तरह से अंत परख सेल lysate प्रोटीन सांद्रता, जो सीधे सेल नंबर के लिए आनुपातिक थे मापने के द्वारा प्रत्येक के लिए प्रारंभिक सेल संख्या में मतभेद के लिए खाते के लिए सामान्यीकृत थे। हमारी प्रोटोकॉल न केवल बाह्य प्रवाह assays के लिए व्यवहार्य लिम्फोसाइटों के तेजी से अलगाव के लिए दिशा निर्देश प्रदान करता है, लेकिन यह भी डेटा की गुणवत्ता से समझौता किए बिना सबऑप्टिमल सेल सांद्रता में काम करने के लिए अनुमति देता है।
प्रोटोकॉल हम शुद्ध और व्यवहार्य लिम्फोसाइट कैंपेन्स, जो बाद में अलग सांद्रता में बाह्य प्रवाह विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया ग्लाइकोलाइसिस और mitochondrial श्वसन प्रदर्शन में अंतर का मूल्यांकन करने के कुशल अलगाव के लिए अनुमति विकसित किया। इस प्रोटोकॉल लिम्फोसाइटों के लिए विशेष रूप से बनाया गया है और विशेष तरह के कम बेसल चयापचय गतिविधि, कमजोरी, कम आवृत्ति के रूप में इन प्रकार की कोशिकाओं से संबंधित कारणों से संबोधित करते हैं, और उनकी असमर्थता परख प्लेटों का पालन करने के लिए। इसलिए, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 11,12 की तुलना में, हमारे विधि इम्यूनोलॉजी के क्षेत्र में काम कर रहे शोधकर्ताओं के लिए एक और अधिक सुविधाजनक और बेहतर अनुकूलित मार्गदर्शन प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण कदम है, शुद्ध और व्यवहार्य सेल आबादी हो रही है, इष्टतम संगम पर चढ़ाना कोशिकाओं, और अच्छी तरह से प्रत्येक में प्रोटीन एकाग्रता के लिए बाह्य प्रवाह परख माप का मानकीकरण भी शामिल हैं।
मैंचढ़ाया दोनों प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा देखे जा सकते हैं और यह भी कोशिकाओं के nitial नंबर प्रोटीन एकाग्रता माप का उपयोग मात्रा निर्धारित किया। सेल नंबर और प्रोटीन एकाग्रता के बीच रैखिक संबंध की पुष्टि की है कि प्रोटीन एकाग्रता वास्तव में एक तरह से अलग कुओं के बीच सेल नंबर में परिवर्तन के प्रभावों का मानकीकरण करने के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्रोटीन सांद्रता के लिए ECAR और ओसीआर परिणाम मानकीकरण करके, हम पता चला कि, कम सेल संगम के बावजूद, के रूप में कुछ के रूप में 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / अच्छी तरह से डेटा की गुणवत्ता से समझौता किए बिना सबसे assays में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, कोशिकाओं है कि सेल प्रकार और assays के बीच विभिन्न इस्तेमाल किया जा सकता की निचली सीमा। उदाहरण के लिए, जबकि कुछ के रूप में 1.25 x 10 5 कोशिकाओं बी सेल ओसीआर माप, यहां तक कि 2.5 x 10 5 कोशिकाओं / के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है अच्छी तरह से एक ही सेल प्रकार की glycolytic प्रदर्शन का आकलन करने के लिए पर्याप्त नहीं थे। इसलिए, जब तक सेल नंबर, एक सीमित कारक नहीं है के रूप में पदभार पर चढ़ाना90% संगम है, जो लगभग 5 x 10 5 लिम्फोसाइट से मेल खाती है / अच्छी तरह से, बेहतर है। आगे अनुकूलन के लिए आवश्यक हो सकता है जब की कोशिकाओं को अलग अलग आकार-तरह के पहले से ही सक्रिय है और आंशिक रूप से विभेदित लिम्फोसाइट-कर रहे हैं इस्तेमाल किया। साथ ही, जब पहले से सुसंस्कृत प्राथमिक लिम्फोसाइट का उपयोग कर, वहाँ अलग उपचार की स्थिति के बीच सेल व्यवहार्यता में एक भिन्नता है, जो मर के बाद से सेल नंबर का एक उपाय के रूप में प्रोटीन एकाग्रता की विश्वसनीयता कम होगा हो सकता है या मर कोशिकाओं को भी मापा प्रोटीन के स्तर के लिए योगदान कर सकते हैं । ऐसे मामलों में, यह cytometry बाह्य प्रवाह assays के बाहर ले जाने से पहले प्रवाह से जीवित कोशिकाओं से हल करने के लिए उपयोगी हो सकता है।
हौसले से अलग और अत्यधिक व्यवहार्य लिम्फोसाइट आबादी का उपयोग हमारे assays में, हम दोनों ओसीआर और ECAR मापन के लिए विश्वसनीय कार्यात्मक डेटा प्राप्त की। सभी प्रकार की कोशिकाओं mitochondrial तनाव की परीक्षा में इसी तरह से व्यवहार करते हैं, सेल प्रकार के बीच हड़ताली मतभेद थेग्लाइकोलाइसिस तनाव परीक्षण में मनाया। उदाहरण के लिए, भोले टी कोशिकाओं की glycolytic प्रदर्शन splenocytes या बी कोशिकाओं की तुलना में कम था, और यह oligomycin के अलावा के साथ बदल नहीं किया था। इस अवलोकन हमारे प्रोटोकॉल की वैधता की पुष्टि, पहले प्रकाशित अध्ययन 7,30 के साथ कतार में है।
अंत में, हमारे विधि एक बाह्य प्रवाह विश्लेषक का उपयोग लिम्फोसाइटों के चयापचय गतिविधि के परीक्षण के लिए एक कुशल और सुविधाजनक तरीका प्रदान करता है, और यह सक्रियण, सेल भेदभाव या नियत पर प्रतिरक्षा कोशिकाओं में चयापचय परिवर्तन की खोज प्रतिरक्षा अध्ययन की एक विस्तृत श्रृंखला में उपयोगी हो सकता है इस तरह के संक्रमण, औतोइम्मुिनित hematologic कैंसर जैसे रोग phenotypes करने के लिए।
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Peña for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.
PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
0.5M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
L-Glutamine 200mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
Sodium pyruvate 100mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
HEPES 1M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis. |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak. |