The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.
Lymfocytter reagere på en række stimuli ved at aktivere intracellulære signalveje, hvilket igen fører til en hurtig cellulær proliferation, migration og differentiering, og cytokinproduktion. Alle disse begivenheder er tæt forbundet med den energi status af cellen, og derfor studere de energiproducerende pathways kan give fingerpeg om den overordnede funktionalitet af disse celler. Det ekstracellulære flux analysatoren er et almindeligt anvendt indretning til evaluering af effektiviteten af glykolyse og mitokondriel respiration i mange celletyper. Dette system er blevet anvendt til at undersøge immunceller i et par offentliggjorte rapporter, endnu en omfattende protokol optimeret specielt for lymfocytter mangler. Lymfocytter er skrøbelige celler, der overlever dårligt i ex vivo betingelser. Ofte lymfocytundergrupper er sjældne, og arbejde med lave celle tal er uundgåelig. Således er en eksperimentel strategi, der omhandler disse vanskeligheder påkrævet. Her giver vi en protokolder tillader hurtig isolering af levedygtige lymfocytter fra lymfevæv, og til analyse af deres metaboliske tilstande i det ekstracellulære flux analysator. Desuden giver vi resultaterne af eksperimenter, hvor de metaboliske aktiviteter af adskillige lymfocyt undertyper ved forskellige celledensiteter blev sammenlignet. Disse observationer antyder, at vores protokol kan anvendes til at opnå ensartede, well-standardiserede resultater selv ved lave cellekoncentrationer, og dermed kan det have brede applikationer i fremtidige undersøgelser, der fokuserer på karakteriseringen af metaboliske begivenheder i immunceller.
Immunresponset mod antigener er en tæt reguleret balance mellem immunaktivering og immunsuppression. Immunaktivering drev hurtig celleproliferation og migration, samt cytokinproduktion, antistofsekretion og forøget fagocytose som reaktion på stimulerende, hvorimod immunsuppression blot inhiberer disse begivenheder, og derfor er det vigtigt at forebygge unødvendige immunresponser 1-6. Nylige undersøgelser har vist, at der foreligger en direkte forbindelse mellem aktiveringsstatus af immunceller og aktiviteten af forskellige metaboliske pathways 7. Immunceller kan skifte mellem hvile og aktiverede tilstande ved at skifte energiproducerende veje til og fra. Endvidere er det blevet observeret, at forskellige immune celletyper kan anvende forskellige metaboliske strategier til brændstof deres øgede energibehov under aktivering. For eksempel, mens aktivering af T-lymfocytter dirigerer celler til en næsten helt glycolytiske tilstand 8 </sup>, aktiverede B-lymfocytter anvender en balance mellem glykolyse og oxidativ phosphorylering 9,10. Disse undersøgelser peger på vigtigheden af at undersøge effekterne af immun celle aktivering på cellulære stofskifte.
Real time, samtidige målinger af forbrug ilt sats (OCR) og ekstracellulær forsuring sats (ECAR), som indikatorer for oxidativ phosphorylering og glykolyse, er en fælles strategi til at løse de stater i energiproducerende veje 11-13. For at opnå dette, et ekstracellulært flux analysator, såsom Seahorse XF 96, anvendes rutinemæssigt. Et sådant instrument kan hurtigt sammenligne ændringer i OCR og ECAR tværs celletyper eller ved forskellige stimulation betingelser. Hidtil forskellige celletyper, herunder immunceller, er blevet studeret ved hjælp af disse enheder. Men en optimeret protokol specielt designet til immunceller er ikke tilgængelig.
Immunceller, især lymfocytter, forskellige fra othendes celletyper i flere kritiske måder. Lymfocytter er skrøbelige celler, der ikke overlever i lange varigheder i ex vivo-betingelser 14-16. Dette er et endnu større problem, når de dyrkes i suboptimal vækstmedium der mangler essentielle næringsstoffer, såsom dem, der anvendes i ekstracellulær flux analyse. I modsætning til makrofager og mange cellelinjer, behøver lymfocytter ikke klæbe til plastoverflader; derfor er det afgørende at vedhæfte dem til analysen pladen uden at generere stress. Endelig kan nogle lymfocytsubpopulationer være yderst sjældne og høste dem på de krævede, optimale mængder kan være udfordrende 17-19.
Her giver vi en optimeret protokol, der er specielt udviklet til lymfocytter. Brug splenocytter, B-lymfocytter og naive CD4 + T-lymfocytter isoleret fra mus milt og lymfeknuder 20, vi viser de særlige kendetegn ved deres hviletilstand glykolyse og oxidativ fosforylering på different celledensiteter. Data blev normaliseret til forklare forskellene i de indledende celleantal for hver brønd ved at måle udgangen assay cellelysat proteinkoncentrationer, som var direkte proportionalt med det celleantal. Vores protokol ikke kun giver retningslinjer for hurtig isolering af levedygtige lymfocytter til ekstracellulære flux assays, men det giver også mulighed for at arbejde på suboptimale cellekoncentrationer uden at forringe kvaliteten af data.
Protokollen Vi udviklede tilladt for effektiv isolering af ren og levedygtig lymfocytundergrupper, som efterfølgende blev anvendt i ekstracellulær flux analyse ved forskellige koncentrationer for at vurdere forskellene i glycolyse og mitokondrielle respiration ydeevne. Denne protokol er designet specielt til lymfocytter og tilgodeser særlige hensyn forbundet med disse celletyper, såsom lav basal metabolisk aktivitet, skrøbelighed, lav frekvens, og deres manglende evne til at klæbe til assayplader. Derfor sammenlignet med tidligere offentliggjorte protokoller 11,12, vores metode giver et mere praktisk og bedre optimeret vejledning til forskere, der arbejder inden for immunologi. Der er flere kritiske trin i denne protokol, herunder at få rene og levedygtige cellepopulationer, plettering af cellerne ved optimal sammenløb, og standardisere de ekstracellulære flux assay målinger proteinkoncentrationen i hver brønd.
Den initial antal celler udpladet kunne begge visualiseres ved lysmikroskopi og også kvantificeres under anvendelse af protein koncentrationsmålinger. Den lineære korrelation mellem celleantal og proteinkoncentration bekræftede, at proteinkoncentrationen faktisk kan anvendes som en måde at standardisere virkningerne af ændringer i celleantal mellem forskellige brønde.
Ved at standardisere de ECAR og OCR-resultater til proteinet koncentrationer viste vi, at der trods lavere celle konfluens, så få som 2,5 x 10 5 celler / brønd kunne anvendes i de fleste assays uden at forringe kvaliteten af dataene. Men den nedre grænse af celler, der kan anvendes svingede mellem celletyper og assays. For eksempel, mens så få som 1,25 x 10 5 celler kan anvendes til B-celle OCR målinger, selv 2,5 x 10 5 celler / brønd var ikke nok til at vurdere den glycolytiske resultater af samme celletype. Derfor så længe celleantal ikke er en begrænsende faktor, plettering til over90% konfluens, hvilket omtrent svarer til 5 x 10 5 lymfocytter / brønd, foretrækkes. Yderligere optimering kan være påkrævet, når celler i forskellige størrelser-såsom tidligere aktiveret og delvist differentierede lymfocytter-anvendes. Derudover, når anvendelse af tidligere dyrkede primære lymfocytter, kan der være en variation i cellelevedygtighed mellem forskellige behandlingsbetingelser, hvilket ville reducere pålideligheden af proteinkoncentrationen som mål for celleantallet siden døde eller døende celler kan også bidrage til de målte proteinniveauer . I sådanne tilfælde kunne det være nyttigt at sortere levende celler ved flowcytometri før der udføres de ekstracellulære flux assays.
I vores assays under anvendelse frisk isolerede og stærkt levedygtige lymfocytpopulationer, opnåede vi pålidelige funktionelle data for både OCR og ECAR målinger. Mens alle celletyper opførte sig på samme måde i den mitokondriske stresstest, markante forskelle mellem celletyper varobserveret i glycolyse stresstest. For eksempel den glycolytiske ydeevne naive T-celler var lav sammenlignet med splenocyter eller B-celler, og det ændrede sig ikke med tilføjelse af oligomycin. Denne observation er i overensstemmelse med tidligere publicerede undersøgelser 7,30, bekræftelse af validiteten af vores protokol.
Afslutningsvis vores metode giver en effektiv og bekvem måde at teste den metaboliske aktivitet af lymfocytter under anvendelse af et ekstracellulært flux analysator, og det kan være nyttigt i en lang række immunologiske undersøgelser udforske de metaboliske ændringer i immunceller ved aktivering, celledifferentiering eller på grund til sygdomsfænotyper såsom infektion, autoimmunitet og hæmatologiske maligniteter.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Peña for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.
PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
0.5M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
L-Glutamine 200mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
Sodium pyruvate 100mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
HEPES 1M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis. |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak. |