The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.
Lymfocyter svara på en mängd olika stimuli genom att aktivera intracellulära signalvägar, vilket i sin tur leder till snabb cellulär proliferation, migration och differentiering, och cytokin produktion. Alla dessa händelser är tätt kopplade till energistatus av cellen, och därför att studera de energiproducerande reaktionsvägar kan ge ledtrådar om den totala funktionaliteten hos dessa celler. Den extracellulära flödesmätare är ett vanligt förekommande anordning för utvärdering av glykolys och mitokondriell andning i många celltyper. Detta system har använts för att studera immunceller i några publicerade rapporter, men ändå en omfattande protokoll speciellt optimerad för lymfocyter saknas. Lymfocyter är ömtåliga celler som överlever dåligt i ex vivo-betingelser. Ofta lymfocytundergrupper är sällsynta, och arbetar med låga cellantal är oundviklig. Således är en experimentell strategi som inriktar sig på dessa problem krävs. Här ger vi ett protokollsom möjliggör snabb isolering av livskraftiga lymfocyter från lymfvävnad, och för analys av deras metaboliska tillstånd i den extracellulära flödes analysatorn. Dessutom ger vi resultaten av experiment där metaboliska aktiviteter flera lymfocyt subtyper vid olika celldensiteter jämfördes. Dessa observationer antyder att våra protokoll kan användas för att uppnå konsekvent, väl standardiserade resultat även vid låga cellkoncentrationer och sålunda kan den ha breda tillämpningar i framtida studier som fokuserar på karakterisering av metaboliska händelser i immunceller.
Immunsvaret mot antigen är en hårt reglerad balans mellan immunaktivering och immunsuppression. Immunaktivering driver snabb cellproliferation och migration, såväl som cytokinproduktion, antikroppsutsöndring och ökad fagocytos som svar på den stimulerande, medan immunsuppression inhiberar helt enkelt dessa händelser och är därför viktig för att förhindra onödiga immunresponser 1-6. Nyligen genomförda studier har visat att en direkt koppling mellan aktiveringsstatus av immunceller och aktiviteten hos olika metaboliska vägar 7. Immunceller kan växla mellan vilande och aktiverade tillstånd genom att byta energiproducerande banor på och av. Vidare har det visat sig att olika immuncelltyper kan använda olika metaboliska strategier för att driva sina ökade energibehovet under aktiveringen. Till exempel, medan aktivering av T-lymfocyter leder celler till en nästan helt glykolytiska state 8 </sup>, aktiverade B-lymfocyter använder en balans mellan glykolys och oxidativ fosforylering 9,10. Dessa studier pekar på vikten av att undersöka effekterna av immuncellsaktivering på cellulär metabolism.
Realtid samtidiga mätningar av syreförbrukning (OCR) och extracellulära försurning hastighet (ECAR), som indikatorer på oxidativ fosforylering och glykolysen är en gemensam strategi för att ta itu med de stater i energiproducerande banor 11-13. För att uppnå detta, en extracellulär flux analysator, såsom Seahorse XF 96, som rutinmässigt används. Ett sådant instrument kan snabbt jämföra förändringar i OCR och ECAR över celltyper eller på olika stimuleringsförhållanden. Hittills, olika celltyper, inkluderande immunceller, varit har studerats med hjälp av dessa enheter. Emellertid är inte tillgängligt ett optimerat protokoll speciellt avsedd för immunceller.
Immunceller, i synnerhet lymfocyter, skiljer sig från othennes celltyper i flera kritiska sätt. Lymfocyter är ömtåliga celler som inte överlever för långa löptider i ex vivo förhållanden 14-16. Detta är en ännu större problem när de odlas i suboptimalt tillväxtmedier som saknar essentiella näringsämnen, såsom de som används i extracellulära flödesanalys. Till skillnad från makrofager och många cellinjer, inte lymfocyter inte följer plastytor; Därför är det viktigt att fästa dem till analysplattan utan att generera stress. Slutligen kan vissa lymfocytsubpopulationer vara extremt sällsynt och skörda dem vid de erforderliga, optimala mängder kan vara utmanande 17-19.
Här ger vi en optimerad protokoll som är särskilt utvecklad för lymfocyter. Använda splenocyter, B-lymfocyter och naiva CD4 + T-lymfocyter isolerade från musmjälte och lymfkörtlar 20, visar vi egenskaperna hos deras vilotillstånd glykolys och oxidativ fosforylering vid skillt celltätheter. Data normaliserades för att ta hänsyn till skillnaderna i de initiala cellantalet för varje brunn genom mätning av slutanalys cellysat proteinkoncentrationer, som var direkt proportionell mot antalet celler. Vår protokoll ger inte bara riktlinjer för snabb isolering av livskraftiga lymfocyter för extracellulära flödesanalyser, men det gör det också möjligt för att arbeta vid suboptimala cellkoncentrationer utan att kompromissa med kvaliteten på uppgifterna.
Det protokoll vi utvecklat tillåtet för effektiv isolering av ren och livsduglig lymfocytundergrupper, som därefter användes i extracellulär flux analys vid olika koncentrationer för att utvärdera skillnader i glykolys och mitokondrisk respiration prestanda. Detta protokoll är speciellt utformad för lymfocyter och tar upp de särskilda överväganden i samband med dessa celltyper, såsom låg basal metabolisk aktivitet, bräcklighet, låg frekvens, och deras oförmåga att följa analysplattor. Därför, jämfört med tidigare publicerade protokoll 11,12, erbjuder vår metod en bekvämare och bättre optimerad guide för forskare som arbetar inom området för immunologi. Det finns flera viktiga steg i detta protokoll, inklusive att få rena och livsdugliga cellpopulationer, plätering cellerna vid optimal sammanflödet och standardisera extracellulära flödesmätningar analys till proteinkoncentrationen i varje brunn.
den initial antal celler pläterade kunde både visualiseras genom Ijusmikroskopi och även kvantifieras med hjälp av mätningar proteinkoncentration. Den linjära korrelationen mellan cellantal och proteinkoncentration bekräftades att proteinkoncentrationen i själva verket kan användas som ett sätt att standardisera effekterna av förändringar i cellantal mellan olika brunnar.
Genom att standardisera ECAR och OCR-resultatet till proteinkoncentrationer, visade vi att trots lägre cell sammanflödet, så få som 2,5 x 10 5 celler / brunn skulle kunna användas i de flesta analyser utan att kompromissa med kvaliteten på uppgifterna. Emellertid den undre gränsen för celler som kan användas varierade mellan celltyper och analyser. Till exempel, medan så få som 1,25 x 10 5 celler kunde användas för B-cells OCR mätningar, till och med 2,5 x 10 5 celler / brunn var inte tillräckligt för att bedöma den glykolytiska prestanda av samma celltyp. Därför, så länge som cellantalet inte är en begränsande faktor, plätering på över90% konfluens, vilket ungefär motsvarar 5 x 10 5 lymfocyter / brunn, är att föredra. Ytterligare optimering kan krävas när celler av olika storlekar-såsom tidigare aktiverad och delvis differentierade lymfocyter-används. Dessutom, när man använder tidigare odlade primära lymfocyter, kan det finnas en variation i cellviabilitet mellan olika behandlingsbetingelser, vilket skulle minska tillförlitligheten av proteinkoncentrationen som ett mått på cellantalet, eftersom döda eller döende celler kan också bidra till de uppmätta proteinnivåer . I sådana fall kan det vara bra att sortera levande celler genom flödescytometri innan utföra de extracellulära flödesanalyser.
I våra analyser med hjälp av nyligen isolerade och mycket livskraftiga lymfocytpopulationer, vi fått tillförlitliga funktionsdata för både OCR och ECAR mätningar. Medan alla celltyper betedde sig på liknande sätt i den mitokondriella stresstestet, var slående skillnader mellan celltyperobserveras i glykolysen stresstestet. Till exempel, var den glykolytiska prestanda naiva T-celler låga jämfört med splenocyter eller B-celler, och det inte förändras med tillsats av oligomycinkänslig. Denna observation är i linje med tidigare publicerade studier 7,30, vilket bekräftar giltigheten av våra protokoll.
Sammanfattningsvis erbjuder vår metod ett effektivt och bekvämt sätt att testa den metaboliska aktiviteten av lymfocyter med användning av en extracellulär flux analysator, och det kan vara användbart i ett brett spektrum av immunologiska studier för att undersöka de metaboliska förändringar i immunceller vid aktivering, celldifferentiering eller på grund till sjukdoms fenotyper såsom infektion, autoimmunitet och hematologiska maligniteter.
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) for support and discussion, Ms. Ann Kim for optimizing the B cell isolation protocol, Dr. Joseph Brzostowski for his help with microscopy, and Ms. Mirna Peña for maintaining the animals used. This study was supported by the Intramural Research Programs of the National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, and National Heart, Lung, and Blood Institute.
PBS (pH 7.2) | Gibco-ThermoFisher | 20012-050 | To make MACS buffer |
Bovine Serum Albumin BSA | Sigma-Aldrich | A3803 | To make MACS buffer |
0.5M EDTA, pH 8 | Quality Biological | 10128-446 | To make MACS buffer |
autoMACS rinsing solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | Instead of PBS + EDTA to make MS buffer. Also used in autoMACS Pro Separator. |
RPMI-1640 | Gibco-ThermoFisher | 11875-093 | Contains phenol red and L-glutamine |
Fetal Bovine Serum | Gibco-ThermoFisher | 10437-028 | For heat-inactivation, thaw frozen stock bottle in a 37 °C water bath and then inactivate at 56 °C for 30 minutes. Aliquot heat-inactivated serum for storage (e.g., in 50 mL conical tubes) and freeze at -20 °C until needed. |
Penicillin-Streptomycin (Pen Strep) | Gibco-ThermoFisher | 15140-122 | Combine Pen Strep with L-Glut 1:1 (if making 500mL media, make a total of 12 mL Pen Strep/L-Glut); keep aliquots at -20 °C until ready to make media. |
L-Glutamine 200mM (L-Glut) | Gibco-ThermoFisher | 25030-081 | Component of RF10 and stress test media |
Sodium pyruvate 100mM | Gibco-ThermoFisher | 11360-070 | Component of RF10 and stress test media |
HEPES 1M | Gibco-ThermoFisher | 15630-080 | Component of RF10 |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco-ThermoFisher | 11140-050 | Component of RF10 |
2-Mercaptoethanol (55 mM) | Gibco-ThermoFisher | 21985-023 | Component of RF10 |
Falcon 70 μm cell strainer | Falcon-Fischer Scientific | 87712 | Used in cell isolation |
Monoject 3 mL Syringe, Luer-Lock Tip | Covidien | 8881513934 | Used in cell isolation |
Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-959-53A | Used in cell isolation |
Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Falcon-Fischer Scientific | 14-432-22 | Used in cell isolation |
ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | Used in cell isolation |
CellTrics 30 μm cell filter, sterile, single-packed | Partec CellTrics | 04-004-2326 | Used in cell isolation |
B Cell Isolation Kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-090-862 | Used in cell isolation |
Naïve CD4+ T cell isolation kit, mouse | Miltenyi Biotec | 130-104-453 | Used in cell isolation |
LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Used in cell isolation |
MidiMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnet for separation |
MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | Holder for magnets |
autoMACS Rinsing Solution | 130-091-222 | Rinsing solution for autoMACS Pro Separator | |
autoMACS Pro Separator Instrument | Miltenyi Biotec | N/A | |
2-Deoxy-D-glucose (2-DG) | Sigma-Aldrich | D8375-5G | |
Cell-Tak | Corning | 354240 | Cell adhesive. Take care to note concentration, as each lot is different (package is 1 mg). |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
2,4 Dinotrophenol (2,4-DNP) | Sigma-Aldrich | D198501 | |
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
Halt Protease Inhibitor Cocktail | ThermoFisher Scientific | 78429 | Supplied as 100X cocktail, combine with RIPA to form 1X solution for lysis. |
RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | Follow manufacturer's instructions |
Seahorse XFe96 FluxPak | Seahorse Bioscience | 101085-004 | Includes assay plates, cartridges, loading guides for transferring compounds to the assay cartridge, and calibrant solution. |
Seahorse XF Base Medium | Seahorse Bioscience | 102353-100 | Used to prepare stress test media |
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Stericup Sterile Vacuum Filter Units, 0.22 μm | EMD Millipore-Fisher Scientific | SCGPU10RE | Used to sterile filter media. |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | 487031 | Dissolved to 0.1M and used to dilute Cell-Tak. |