Her præsenterer vi en detaljeret protokol af (A) identifikation af et naturligt produkt med antibiotisk aktivitet, (B) rensning af forbindelsen, (C) den første model af sin biosyntese, (D) genomsekvensering / -mining og ( E) kontrol af biosyntetiske gen-klyngen.
Streptomyces-stammer er kendt for deres evne til at producere en masse forskellige forbindelser med forskellige bioaktiviteter. Dyrkning under forskellige betingelser fører ofte til fremstilling af nye forbindelser. Derfor er produktionskulturer af stammerne ekstraheret med ethylacetat, og de rå ekstrakter analyseres ved HPLC. Endvidere er ekstrakterne testes for deres bioaktivitet ved forskellige assays. For Strukturopklaring forbindelsen af interesse oprenses ved en kombination af forskellige kromatografiske metoder.
Genomsekvensering kombineret med genom minedrift tillader identifikation af et naturligt produkt biosyntetisk gen clusteret under anvendelse af forskellige computerprogrammer. For at bekræfte, at den korrekte genklyngen er blevet identificeret, geninaktivering eksperimenter skal udføres. De resulterende mutanter analyseres for produktion af den bestemte naturprodukt. Når den korrekte genklyngen er blevet inaktiveret, denstamme bør ikke producere forbindelsen.
Arbejdsgangen er vist for antibakterielle forbindelse polyketomycin produceret af Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Omkring ti år siden, da genomsekvensering stadig var meget dyrt, kloning og identifikation af en genklynge var en meget tidskrævende proces. Hurtig genom sekventering kombineret med genom minedrift accelererer retssagen mod identifikation klynge og åbner op for nye måder at udforske biosyntese og til at generere nye naturlige produkter ved genetiske metoder. Den i dette dokument protokol kan henføres til nogen anden forbindelse afledt af en Streptomyces-stamme eller en anden mikroorganisme.
Naturprodukter fra planter og mikroorganismer har altid været en vigtig kilde til klinisk lægemiddeludvikling og forskning. Den første antibiotikum Penicillin blev opdaget i 1928 fra en svamp af Alexander Fleming 1. I dag er mange mere naturlige produkter, der anvendes i klinisk behandling.
En slægt kendt for sin evne til at producere forskellige typer af sekundære metabolitter med forskellige bioaktiviteter er Streptomyces. Streptomyces er Gram-positive bakterier og tilhører klassen af aktinobakterier og ordren Actinomycetales. Næsten to tredjedele af de klinisk anvendte antibiotika er afledt af Actinomycetales, hovedsagelig fra Streptomyces, som amphotericin 2, daptomycin 3 eller tetracyclin 4. To Nobelpriser er tildelt inden for Streptomyces antibiotisk forskning. Den første gik til Selman Waksman for opdagelsen af streptomycin, den første entibiotic effektiv mod tuberkulose. 5 I 2015 som en del af Nobelprisen i fysiologi og medicin, opdagelsen af avermectin fra S. avermitilis blev tildelt så godt. Avermectin anvendes til behandling af parasitiske sygdomme 6,7.
Den traditionelle tilgang til opdagelsen af naturlige produkter i mikroorganismer, såsom Streptomyces generelt indebærer dyrkning af stammen under forskellige vækstbetingelser, samt ekstraktion og analyse af sekundære metabolitter. Bioaktivitetsanalyser (f.eks assays for antibakteriel og anticanceraktivitet) udføres for at detektere aktivitet af forbindelsen. Endelig er forbindelsen af interesse isoleres og den kemiske struktur belyses.
Strukturerne af naturlige produkter er ofte sammensat af enkelte dele, som er ved at danne komplekse molekyler. Der er et par, men begrænsede, større biosynteseveje fører til opbygning af blokks, der anvendes til biosyntese af naturlige produkter. De store biosyntetiske veje er polyketid veje, stier, der fører til terpenoider og alkaloider, stier ved hjælp aminosyrer og veje, der fører til sukkergrupper. Hver vej er kendetegnet ved en række specifikke enzymer 8. Baseret på strukturen af forbindelsen, kan disse biosyntetiske enzymer forudsiges.
I dag kan den detaljerede strukturelle analyse af en forbindelse i kombination med næste generation sekventering og bioinformatisk analyse hjælpe med at identificere den ansvarlige biosyntetiske genklyngen. Oplysningerne klynge åbner nye veje for yderligere naturprodukt forskning. Dette omfatter heterolog ekspression at forøge udbyttet af det naturlige produkt, målrettet forbindelse modifikation af gendeletion eller ændring og kombinatorisk biosyntese med gener fra andre veje.
Polyketomycin blev isoleret uafhængigt fra dyrkningsvæsken afto stammer, Streptomyces sp. MK277-AF1 9 og Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 10. Strukturen blev belyst ved NMR og røntgen-analyse. Polyketomycin er sammensat af en tetracyklisk decaketid og et dimethyl salicylsyre, forbundet af de to deoxysugar dele p-D-amicetose og α-L-axenose. Det viser cytotoksiske og antibiotisk aktivitet, selv mod grampositive multiresistente stammer, såsom MRSA 11.
Et genomisk cosmid bibliotek af S. diastatochromogenes Tü6028 blev genereret og screenet for mange år siden. Brug specifikt gen sonder polyketomycin gen klynge med en størrelse på 52,2 kb, der indeholder 41 gener, blev identificeret efter flere måneders intenst arbejde 12. For nylig blev et udkast genomsekvens af S. diastatochromogenes opnået fører til hurtig identifikation af den polyketomycin biosyntetiske genklyngen. I denne oversigt, en fremgangsmåde med til at identificere et naturprodukt og belyse dets biosyntetiske genklynge vil blive beskrevet ved hjælp polyketomycin som eksempel.
Her forklarer vi de enkelte trin, der fører fra et naturligt produkt til sin biosyntetiske genklynge vist for polyketomycin produceret af Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Protokollen omfatter identificering og oprensning af et naturligt produkt med antibiotiske egenskaber. Yderligere strukturel analyse og sammenligning med resultater fra genom minedrift føre til identifikation af den biosyntetiske gen-klyngen. Denne procedure kan anvendes på enhver anden forbindelse afledt af en Streptomyces-stamme eller en anden mikroorganisme.
I denne opgave et genomisk cosmid bibliotek af Streptomyces diastatochromogenes blev genereret og screenet for mange år siden, hvilket resulterer i identifikationen af polyketomycin genklyngen via en yderst tidskrævende proces. Karakterisering af enkelte gener var mulig under anvendelse af målgenet deletioner og analyse af de resulterende mutanter 12. For nylig blev et udkast genomsekvens af S. diastatochromogenes opnået muliggør hurtig identifikation af den polyketomycin biosyntetiske genklyngen. Vi kunne nemt registrere de biosyntetiske gener, selv om udkastet genom sekvens indeholder stadig mange contigs. Den beskrevne proces kan opnås inden for måneder. Men proceduren omfatter, mange trin. Enkelte trin kan mislykkes flere gange, forhindrer progression til efterfølgende trin:
Slægten Streptomyces er kendt for sin evne til at producere bioaktive stoffer. Mens de bærer ofte mere end 20 biosynthetic gen klynger, som regel kun en eller to forbindelser er fremstillet under laboratorieforhold. Anvendelsen af OSMAC tilgang (dyrkning af en stamme under forskellige betingelser) til at vågne op tavse gen klynger kan nogle gange ikke være nok. Genetisk manipulation af regulatoriske gener, såsom de pleiotrope regulator gener ADPA 44 og bldA 45,46, er også en effektiv metode til at aktivere produktionen af andre sekundære metabolitter.
Til belysning af forbindelsens struktur, fx ved NMR-analyse, som regel mere end 2 mg oprenset forbindelse er nødvendig. Derfor er fermentering af mere end 10 L kultur ofte påkrævet. Uden en fermenter der er i stand til at opretholde ilt, pH og temperaturforhold, kan det være en udfordring i en lille laboratorium til at håndtere denne mængde af kultur og efterfølgende udvinding. Under oprensning kan forbindelsen blive ændret på grund af oxidation, stråling eller temperatur.Også, bruges flere oprensningstrin, jo større er chancen for nedbrydning.
Ved analyse af strukturen af det naturlige produkt, og klyngerne i genomet, nogle gange er det ikke så let at identificere den passende klynge. For det første, hvis der kun er et udkast genomsekvens en del af klyngen kan mangle. For det andet er det ikke alle gener, der er nødvendige for biosyntesen er i klyngen. For det tredje, undertiden en klynge er delt i to dele er adskilt fra hinanden af mange kilobaser. For det fjerde kan det være vanskeligt at afgøre, hvilken en er det passende gen klyngen. I tilfælde af store PKS type I eller NRPS systemer, hvor det er muligt at beregne antallet af extender enheder baseret på antallet af moduler, eller endda identificere de enkelte extender enheder ved at analysere Valg domæner, viser det sig op let. Men i tilfælde af iterativt arbejder enzymer, forudsigelse af de syntetiserede forbindelser er ofte ikke muligt, især hvis strai har mere end 40 genklynger. For det femte, naturen er meget kompleks og fuld af endnu ukendte forbindelser. Ofte biosyntesen er en blanding af forskellige veje. Hvis den nye sammensatte ikke er identificeret endnu, eller ikke relateret til en anden forbindelse, kan det være vanskeligt at identificere klyngen, til at foreslå en biosyntese model og for at bevise det.
Når bundtet er afgrænset, er enkelt crossover teknik er en god og hurtig metode til at kontrollere hypotesen. PCR, kloning i en selvmord vektor, konjugering, udvælgelse af positive kloner, og produktion assay er de eneste nødvendige trin. En ulempe ved denne teknik er, at integrationen af vektoren i kromosomet er ikke stabilt på grund af yderligere rekombinationsbegivenheder. Derfor, for at analysere enkelte gener, er præcise gendeletioner påkrævet. Det kan også være svært at manipulere Streptomyces pres på det genetiske niveau.
Den beskrevne procedure kan tildeles to enhver anden forbindelse fremstillet af en Streptomyces-stamme eller en anden mikroorganisme. Den viden om en biosyntetisk gen klynge og dens syntetiseret forbindelse giver os yderligere muligheder for at ændre allerede eksisterende molekyler med det formål at forbedre dem til bekæmpelse af multiresistente patogener.
The authors have nothing to disclose.
S. Zhang is funded by China Scholarship Council. The authors are very grateful to former people working on polyketomycin project in this lab and Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler, University of Tübingen, for providing the polyketomycin producer. The research was supported by the DFG (RTG 1976).
agar | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5210.4 | |
agarose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6352.4 | |
D-mannitol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4175.1 | |
glucose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | |
LB | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X964.3 | |
malt extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X976.2 | |
MgCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2189.1 | |
Peptone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | ||
soy flour | W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany | Hensec-Vollsoja | |
tryptic soy broth | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X938.3 | Caso-Bouillon |
yeast extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
Solvents | |||
Acetic acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3738.5 | |
Acetone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9372.2 | |
Acetonitrile | Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands | JT-9012-03 | |
Dichlorofrom | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 1530754 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | |
DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9atom%D | ARMAR Chemicals, Döttingen, Switzerland | 15200.204 | |
Ethyl acetate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6784.4 | |
Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6331.4 | |
Methanol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 7342.1 | |
Enzymes | |||
restriction enzymes | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
polymerase | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment | Promega GmbH, Mannheim, Germany | ||
Antibiotics | |||
apramycin | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A7682.0005 | |
fosfomycin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany | P5396-50G | |
kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
Plasmid/Vectors | |||
pKC1132 | Bierman et al. 1992 | ||
Primer | |||
pokPI_for | TGATGGTGCCGCTGGCCATGG | Primer to amplify fragment containing pokPI gene | |
pokPI_rev | AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC | ||
Bacterial strains | |||
Bacillus subtilis COHN ATCC6051 | Gram-positive test strain | ||
Escherichia coli ET12567 pUZ8002 | MacNeil et al., 1992 | strain for conjugation | |
Escherichia coli XL1 Blue | Agilient Technologies, Santa Clara, USA | Gram-negative test strain + cloning host | |
Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 | Paululat et al., 1999 | Polyketomycin producer | |
Online services | |||
antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell) | http://antismash.secondarymetabolites.org/ | Detection of secondary metabolite gene cluster | |
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | finds regions of similarity between biological sequences | |
GenDB | https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb | Annotation of ORFs | |
MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster) | http://mibig.secondarymetabolites.org/ | Database of biosyntetic gene clusters | |
NaPDoS | http://napdos.ucsd.edu/ | Detection of seconary metabolite gene cluster | |
NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/ | Annotation of ORFs | |
NRPSpredictor | http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/ | Detection of NRPS domains | |
Prokka (rapid prokaryotic genome annotation) | http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml | Annotation of ORFs | |
RAST (rapid annotation using subsystems technology) | http://rast.nmpdr.org/ | Annotation of ORFs | |
other programs | |||
Chem Station Rev. A.09.03 | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | Handling program for HPLC | |
Clone Manager Suite 7 | Scientific and Educational Software, Cary, USA | Designing Cloning Experiment | |
Newbler v2.8 | Roche Diagnostics | Alignment of sequencing reads | |
Machines | |||
Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10 | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | ||
HPLC/MS | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Autosampler: G1313A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm; Particle size: 3.5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Column:Xbridge C18 (100 mm × 4.6 mm; Particle size: 3.5 μm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_semi-prep Pre-Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_semi-prep Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Degasser: G1322A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Quarternary pump: G1311A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Diode array detector (DAD )G1315B (λ = 254 nm and 400 nm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Quadrupole mass detector (MSD) G1946D(2-3000 m/z) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
rotary evaporator | |||
_heating bath Hei-VAP Value/G3 | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany | ||
_vacuum pump system SC 920 G | KNF Global Strategies AG, Sursee, Switzerland | ||
other material | |||
Sephadex LH20 | GE Healthcare, | ||
Chromafil PVDF-45/15MS (pore size 0.45 µm; filter Ø15 mm) | MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Germany | ||
SPE column Oasis HLB 20 35 cc (6g) | Waters GmbH, Eschborn, Germany | ||
E. coli | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
Bacillus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
Streptomyces sp. | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: TSB, Composition: CASO Boullion, Amount to 1 L H2O: 30 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Yeast extract, Amount to 1 L H2O: 10 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Peptone, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Glucose, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
for agar plates add 2 % agar |